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摘要[目的]了解野生秦岭羚牛瘤胃产甲烷古菌的组成及其多样性。[方法]提取野生秦岭羚牛瘤胃内容物总DNA，选用产甲烷菌特异性引物 Met86F和Met1340R，对总DNA进行16S rRNA特异性扩增，构建秦岭羚牛瘤胃产甲烷古菌16S rRNA克隆文库，对阳性克隆进行PCR-RFLP（限制性内切酶片段长度多态性）分析，并对Hae Ⅲ 酶切带谱不同的菌液进行测序，构建系统发育树。[结果]根据酶切带谱分析和测序结果的不同，将随机挑取的105个阳性克隆归为14个不同的可操作分类单元（OTUs）。系统发育分析表明，这些克隆序列均位于广域古菌门（Euryarchaeota），隶属甲烷杆菌科（Methanobacteriaceae，65.71%）、Methanomassiliicoccus（29.52%）和Methanosarcinaceae（4.76%）3个科。其中有57个序列与可培养菌相似度在97%以上，分属于Methanobrevibacter millerae、Methanobrevibacter olleyae 和Methanobrevibacter thaueri。其余48个序列与未培养菌相似度较高，占11个OTUs。[结论]野生秦岭羚牛瘤胃产甲烷古菌多样性比较丰富，且可能存在新的分类单元。
关键词野生秦岭羚牛；瘤胃；产甲烷古菌；分子多樣性
中图分类号S852.6；Q939文献标识码
A文章编号0517-6611（2018）08-0088-04
Study on the Diversity of Methanogenic Archaea in the Rumen of Wild Budorcas taxicolor bedfordi
LAN Afeng1，2，YANG Man1，GUO Sufen1 et al（1.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong，Shaanxi 723001；2.Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi，Hanzhong，Shaanxi 723001）
Abstract[Objective] To investigate the composition and diversity of methanogenic archaea in the rumen of wild Budorcas taxicolor bedfordi.[Method]Total DNA was extracted from rumen content of wild B.taxicolor.A pair of methanogenic archaea’s specific PCR primers were used for 16S rRNA specific amplification and a clone library was constructed for the DNA samples.Positive clones were analyzed by PCRrestriction fragment length polymorphism （PCRRFLP） and the clones with unique HaeⅢ patterns were selected for sequencing and constructing 16S rRNA gene phylogenetic tree.[Result] Based on HaeⅢ digestion and sequencing results，a total of 105 positive clones randomly screened from the library were classified into 14 operational taxonomic units （OTUs）.Phylogenetic analysis showed that these clone squences belonged to Euryarchaeota and they were divided into three families：Methanobacteriaceae，Methanomassiliicoccus and Methanosarcinaceae.The similarity between 57 sequences and cultured archaea was above 97% and they belonged to Methanobrevibacter millerae，Methanobrevibacter olleyae and Methanobrevibacter thaueri. Other 48 sequences had an higher similarity with uncultured archae，containing 11 OTUs.[Conclusion] The methanogenic archaea in the rumen of wild B.taxicolor had an abundant diversity methanogens and there might be a new taxon.
Key wordsWild Budorcas taxicolor bedfordi；Rumen；Methanogenic archaea；Molecular diversity
基金项目陕西理工学院人才引进启动项目（SLGQD-8）。 作者简介兰阿峰（1978—），男，陕西宜川人，讲师，博士，从事肠道微生物多样性研究。
收稿日期2017-11-13；修回日期2017-11-16
秦岭羚牛（Budorcas taxicolor bedfordi），隶属偶蹄目牛科，属于国家一级保护动物，与大熊猫、金丝猴、朱鹮并称为“秦岭四宝”[1]。野生秦岭羚牛可采食多种植物，食物结构丰富[2]。瘤胃是一个含有大量微生物的厌氧生态系统，在反刍动物的食物消化与营养代谢中起着非常重要的作用[3]。Wright等[4]研究表明反刍动物瘤胃中含有细菌、古菌、原虫、真菌和病毒。瘤胃古菌主要是产甲烷菌（Methanogens），产甲烷菌在清除瘤胃发酵过程中产生的氢气方面扮演着重要角色，它能将氢气、甲酸、乙酸等转化成甲烷和CO2，并从中获取能量[5]。目前瘤胃产甲烷菌的研究日益受到重视，对其分子多样性的研究主要是通过古菌特异性引物进行16S rRNA的克隆分析[6-8]。Wright等[7]以引物 Met86F和Met1340R 对西澳大利亚绵羊瘤胃的产甲烷菌进行克隆，发现Methanobrevibacter、Methanotorris 和Methanosphaera 3 个属的产甲烷菌。裴彩霞等[8-9]以3对产甲烷菌引物对晋南牛瘤胃产甲烷菌多样性进行了研究，发现引物 Met86F和Met1340R 克隆較为全面，又利用该引物研究了山羊瘤胃产甲烷菌，发现甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）为优势菌群。
关于野生秦岭羚牛瘤胃产甲烷古菌的研究鲜见报道。笔者采用引物Met86F和Met1340R对野生秦岭羚牛瘤胃产甲烷古菌的16S rRNA 进行克隆并构建系统发育树，分析其瘤胃产甲烷菌的多样性，以期为瘤胃微生物多样性的研究提供数据支持，也为更好地掌握瘤胃代谢和微生物相互之间的关系，为合理应用饲料、开辟新的饲料资源提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试材料。采集野生秦岭羚牛瘤胃内容物，冻存于-80 ℃冰箱待用。
1.1.2主要仪器和试剂。凝胶扫描成像系统（美国Bio-rad）、高速冷冻离心机（Centrifuge 5424R，德国Eppendorf）、PCR扩增仪（TC4000，英国TECHNE）、核酸测定仪（Bio Photometer plus，德国Eppendorf）、美国Mo Bio公司Ultra Clear Fecal DNA Isolation Kit提取试剂盒、感受态细胞制备试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）、pMD19-T Vector （TaKaRa）、Sanprep 柱式DNA胶回收试剂盒、PCR产物快速克隆试剂盒、Taq DNA 聚合酶、PCR引物、X-gal、IPTG等试剂均购自上海生工。
1.2瘤胃产甲烷古菌16S rRNA克隆文库的构建
1.2.1材料的获得。试验材料取自陕西省佛坪自然保护区，通过胃管采集野生秦岭羚牛瘤胃内容物，冻存于-80 ℃冰箱待用。
1.2.2总DNA提取。总DNA的提取按照Ultra Clear Fecal DNA Isolation Kit提取试剂盒说明书进行。
1.2.316S rRNA扩增。产甲烷古菌16S rRNA通用引物的选择参考裴彩霞等[8-9]和Wright等[10]的研究，采用引物 Met86F（5'-GCTCAGTAACACGTGG-3'）和Met1340R（5'- CGGTGTGTGCAAGGAG -3'）进行扩增，预期扩增长度在1 260 bp左右（含引物长度）。PCR反应体系（50 μL）如下：2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，模板DNA 4 μL，ddH2O 17 μL。PCR反应程序如下：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共 34个循环；72 ℃10 min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.2.4克隆文库的构建及阳性克隆的筛选。Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒将扩增后1 260 bp左右的目的条带切胶纯化回收。纯化产物与pMD-19T vector连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞，阳性克隆子的初步筛选参照文献[11]：将转化后的细胞涂布含氨苄青霉素（100 mg/L）、X-gal、IPTG的LB琼脂平板37 ℃避光培养12～16 h 进行蓝白斑筛选。
1.3PCR-RFLP分析
挑取阳性克隆子用pMD19-T Vector载体通用引物M13-47和M13-48对插入片段进行菌落PCR扩增，PCR产物电泳检测对目标插入片段进一步进行验证。菌落PCR体系（20 μL）：2×Taq Master Mix 10 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 6 μL，菌液1 μL。菌落PCR反应程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共34个循环；72 ℃10 min。利用限制性内切酶HaeⅢ 对菌落PCR产物于37 ℃下酶切4 h，酶切体系（20 μL）如下：10×Buffer 2 μL、HaeⅢ 1 μL、PCR产物5 μL、ddH2O 12 μL。酶切产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。酶切图谱用Quantity One软件进行分析，选取酶切带型不同的代表克隆对应的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司，进行测通测序。将HaeⅢ 酶带谱切分析不同且测序结果也不同的克隆归为1个OTUs。克隆文库覆盖率计算公式如下：C=[1-（n/N）]×100%[12]。式中，n代表在16S rRNA 克隆文库仅出现一次的OTU数量，N代表16S rRNA克隆文库的总数。 1.4克隆文库发育分析
测序结果使用DNAMAN 6.0软件去除载体序列后提交到NCBI网络进行Blast检索[13]，下载同源性较高的模式菌株的数据，生成Fasta格式文件。使用Clustal X软件对所得序列进行人工校正及比对分析。利用Mega 5软件，按照Neighbor-Joining法聚类选择1 000个重复进行Bootstrap值分析后，构建系统发育树。将所得16S rRNA序列提交GenBank数据库，申请登陆号为KM103518～KM103520和KM073422～KM073435。
2结果与分析
2.1总DNA提取及16S rRNA特异性扩增
提取野生秦岭羚牛瘤胃内容物总DNA，用产甲烷古菌16S rRNA通用引物进行特异性扩增，得到约1 260 bp的目标片段（图1）。
2.2PCR-RFLP分析
从构建的16S rRNA克隆文库中随机挑选150个阳性克隆，以质粒通用引物进行菌落PCR 扩增，扩增产物（大于1 200 bp）用限制性内切酶HaeⅢ 进行插入目的片段的RFLP分析，挑选酶切带谱不同的克隆（共118个）送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序部测序。将测序结果去除嵌合序列，并排除重复序列后共得到14个OTUs（代表105个有效序列）。根据公式，计算出克隆文库的覆盖率C为97.1%，可以代表野生秦嶺羚牛瘤胃产甲烷古菌的多样性。
2.3产甲烷古菌16S rRNA系统发育分析
选取不同酶切带谱对应的阳性克隆进行测序，根据序列比对结果可将105个阳性克隆（去除嵌合体和重复序列）归为14个OTUs。序列比对结果表明，这些序列均位于广域古菌门（Euryarchaeota），分属于Methanobacteriaceae、Methanomassiliicoccus和Methanosarcinaceae 3个科。54.29% （代表57个序列）的序列与可培养菌相似度在97%以上，分属于Methanobrevibacter millerae（42个序列）、Methanobrevibacter olleyae（12个序列）和Methanobrevibacter thaueri（3个序列），相似度从99.00%到96.91%不等。另有48个序列与未培养菌相似度较高（与已培养菌的序列比对相似度低于未培养菌），分属11个OTUs，其中1个OTUs（DQ445723）所占比例最高（33.33%，代表16个序列），这16个序列与DQ445723的相似度从97.27%到97.02%不等。在所有序列（105个序列）中，77个序列的比对结果相似度在97%以上，占总序列的73.33%（表1）。
根据产甲烷古菌16S rRNA序列构建的系统发育树见图2。由图2可知，系统发育树共分为3支，其中一支与甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）聚在一起，未培养古菌G53和G98也聚在这一支；另一支为未培养古菌，未能确定种属；G16单独一支，与甲烷食甲基菌属（Methanomethylovorans）聚在一起，代表可能有新的操作分类单元。
3结论与讨论
该研究获得了野生秦岭羚牛瘤胃产甲烷古菌的16S rRNA序列，序列比对结果表明甲烷短杆菌属为最优势菌群，占总克隆的54.29%，与裴彩霞等[9]的山羊瘤胃产甲烷杆菌的研究结果相一致[9]。克隆中有48个序列与未培养菌相似度较高，占11个OTUs，未能确定种属；另有一个OTUs在发育树中形成独立分支。
综合比较目前的研究报道发现，许多研究出现相同试验对象，不同试验所获得的瘤胃产甲烷菌的多样性不同，笔者认为其结果主要是由以下原因造成的：①引物的不同造成克隆多样性的不同。目前对瘤胃产甲烷菌的分子多样性的研究对象主要有山羊[9，14]、绵羊[15-16]和奶牛[17-18]等。Tajima等[6]对荷斯坦奶牛瘤胃产甲烷菌的多样性进行探究，结果表明引物0025cF/1429R较引物D30/D33探测到的产甲烷菌多样性多。裴彩霞等[9]研究表明引物Met86F和Met1340R 克隆比其他2对引物（1Af/1100Ar和Archf364/Archr1386）较为全面。引物的不同导致克隆多样性也有所区别。引物退火温度及扩增效率的不同，引物结合部位周围的结构以及不同扩增模板的特性都会导致不同引物优先扩增的菌群不同，因而造成多样性的差异。因此，对于羚牛瘤胃产甲烷古菌的多样性，还需用不同引物进行研究。②动物所采食日粮的不同，造成瘤胃内微生物的组成不同[15，19]。日粮可能通过影响瘤胃发酵类型等因素对瘤胃微生物多样性和数量产生影响。该试验中羚牛是在陕西佛坪自然保护区内自然放牧，取得瘤胃内容物的时间是冬季，其野生状态及取样时间同样是影响其瘤胃内产甲烷菌多样性的重要因素。
参考文献
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关键词野生秦岭羚牛；瘤胃；产甲烷古菌；分子多樣性
中图分类号S852.6；Q939文献标识码
A文章编号0517-6611（2018）08-0088-04
Study on the Diversity of Methanogenic Archaea in the Rumen of Wild Budorcas taxicolor bedfordi
LAN Afeng1，2，YANG Man1，GUO Sufen1 et al（1.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong，Shaanxi 723001；2.Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi，Hanzhong，Shaanxi 723001）
Abstract[Objective] To investigate the composition and diversity of methanogenic archaea in the rumen of wild Budorcas taxicolor bedfordi.[Method]Total DNA was extracted from rumen content of wild B.taxicolor.A pair of methanogenic archaea’s specific PCR primers were used for 16S rRNA specific amplification and a clone library was constructed for the DNA samples.Positive clones were analyzed by PCRrestriction fragment length polymorphism （PCRRFLP） and the clones with unique HaeⅢ patterns were selected for sequencing and constructing 16S rRNA gene phylogenetic tree.[Result] Based on HaeⅢ digestion and sequencing results，a total of 105 positive clones randomly screened from the library were classified into 14 operational taxonomic units （OTUs）.Phylogenetic analysis showed that these clone squences belonged to Euryarchaeota and they were divided into three families：Methanobacteriaceae，Methanomassiliicoccus and Methanosarcinaceae.The similarity between 57 sequences and cultured archaea was above 97% and they belonged to Methanobrevibacter millerae，Methanobrevibacter olleyae and Methanobrevibacter thaueri. Other 48 sequences had an higher similarity with uncultured archae，containing 11 OTUs.[Conclusion] The methanogenic archaea in the rumen of wild B.taxicolor had an abundant diversity methanogens and there might be a new taxon.
Key wordsWild Budorcas taxicolor bedfordi；Rumen；Methanogenic archaea；Molecular diversity
基金项目陕西理工学院人才引进启动项目（SLGQD-8）。 作者简介兰阿峰（1978—），男，陕西宜川人，讲师，博士，从事肠道微生物多样性研究。
收稿日期2017-11-13；修回日期2017-11-16
秦岭羚牛（Budorcas taxicolor bedfordi），隶属偶蹄目牛科，属于国家一级保护动物，与大熊猫、金丝猴、朱鹮并称为“秦岭四宝”[1]。野生秦岭羚牛可采食多种植物，食物结构丰富[2]。瘤胃是一个含有大量微生物的厌氧生态系统，在反刍动物的食物消化与营养代谢中起着非常重要的作用[3]。Wright等[4]研究表明反刍动物瘤胃中含有细菌、古菌、原虫、真菌和病毒。瘤胃古菌主要是产甲烷菌（Methanogens），产甲烷菌在清除瘤胃发酵过程中产生的氢气方面扮演着重要角色，它能将氢气、甲酸、乙酸等转化成甲烷和CO2，并从中获取能量[5]。目前瘤胃产甲烷菌的研究日益受到重视，对其分子多样性的研究主要是通过古菌特异性引物进行16S rRNA的克隆分析[6-8]。Wright等[7]以引物 Met86F和Met1340R 对西澳大利亚绵羊瘤胃的产甲烷菌进行克隆，发现Methanobrevibacter、Methanotorris 和Methanosphaera 3 个属的产甲烷菌。裴彩霞等[8-9]以3对产甲烷菌引物对晋南牛瘤胃产甲烷菌多样性进行了研究，发现引物 Met86F和Met1340R 克隆較为全面，又利用该引物研究了山羊瘤胃产甲烷菌，发现甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）为优势菌群。
关于野生秦岭羚牛瘤胃产甲烷古菌的研究鲜见报道。笔者采用引物Met86F和Met1340R对野生秦岭羚牛瘤胃产甲烷古菌的16S rRNA 进行克隆并构建系统发育树，分析其瘤胃产甲烷菌的多样性，以期为瘤胃微生物多样性的研究提供数据支持，也为更好地掌握瘤胃代谢和微生物相互之间的关系，为合理应用饲料、开辟新的饲料资源提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试材料。采集野生秦岭羚牛瘤胃内容物，冻存于-80 ℃冰箱待用。
1.1.2主要仪器和试剂。凝胶扫描成像系统（美国Bio-rad）、高速冷冻离心机（Centrifuge 5424R，德国Eppendorf）、PCR扩增仪（TC4000，英国TECHNE）、核酸测定仪（Bio Photometer plus，德国Eppendorf）、美国Mo Bio公司Ultra Clear Fecal DNA Isolation Kit提取试剂盒、感受态细胞制备试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）、pMD19-T Vector （TaKaRa）、Sanprep 柱式DNA胶回收试剂盒、PCR产物快速克隆试剂盒、Taq DNA 聚合酶、PCR引物、X-gal、IPTG等试剂均购自上海生工。
1.2瘤胃产甲烷古菌16S rRNA克隆文库的构建
1.2.1材料的获得。试验材料取自陕西省佛坪自然保护区，通过胃管采集野生秦岭羚牛瘤胃内容物，冻存于-80 ℃冰箱待用。
1.2.2总DNA提取。总DNA的提取按照Ultra Clear Fecal DNA Isolation Kit提取试剂盒说明书进行。
1.2.316S rRNA扩增。产甲烷古菌16S rRNA通用引物的选择参考裴彩霞等[8-9]和Wright等[10]的研究，采用引物 Met86F（5'-GCTCAGTAACACGTGG-3'）和Met1340R（5'- CGGTGTGTGCAAGGAG -3'）进行扩增，预期扩增长度在1 260 bp左右（含引物长度）。PCR反应体系（50 μL）如下：2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，模板DNA 4 μL，ddH2O 17 μL。PCR反应程序如下：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共 34个循环；72 ℃10 min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.2.4克隆文库的构建及阳性克隆的筛选。Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒将扩增后1 260 bp左右的目的条带切胶纯化回收。纯化产物与pMD-19T vector连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞，阳性克隆子的初步筛选参照文献[11]：将转化后的细胞涂布含氨苄青霉素（100 mg/L）、X-gal、IPTG的LB琼脂平板37 ℃避光培养12～16 h 进行蓝白斑筛选。
1.3PCR-RFLP分析
挑取阳性克隆子用pMD19-T Vector载体通用引物M13-47和M13-48对插入片段进行菌落PCR扩增，PCR产物电泳检测对目标插入片段进一步进行验证。菌落PCR体系（20 μL）：2×Taq Master Mix 10 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 6 μL，菌液1 μL。菌落PCR反应程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共34个循环；72 ℃10 min。利用限制性内切酶HaeⅢ 对菌落PCR产物于37 ℃下酶切4 h，酶切体系（20 μL）如下：10×Buffer 2 μL、HaeⅢ 1 μL、PCR产物5 μL、ddH2O 12 μL。酶切产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。酶切图谱用Quantity One软件进行分析，选取酶切带型不同的代表克隆对应的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司，进行测通测序。将HaeⅢ 酶带谱切分析不同且测序结果也不同的克隆归为1个OTUs。克隆文库覆盖率计算公式如下：C=[1-（n/N）]×100%[12]。式中，n代表在16S rRNA 克隆文库仅出现一次的OTU数量，N代表16S rRNA克隆文库的总数。 1.4克隆文库发育分析
测序结果使用DNAMAN 6.0软件去除载体序列后提交到NCBI网络进行Blast检索[13]，下载同源性较高的模式菌株的数据，生成Fasta格式文件。使用Clustal X软件对所得序列进行人工校正及比对分析。利用Mega 5软件，按照Neighbor-Joining法聚类选择1 000个重复进行Bootstrap值分析后，构建系统发育树。将所得16S rRNA序列提交GenBank数据库，申请登陆号为KM103518～KM103520和KM073422～KM073435。
2结果与分析
2.1总DNA提取及16S rRNA特异性扩增
提取野生秦岭羚牛瘤胃内容物总DNA，用产甲烷古菌16S rRNA通用引物进行特异性扩增，得到约1 260 bp的目标片段（图1）。
2.2PCR-RFLP分析
从构建的16S rRNA克隆文库中随机挑选150个阳性克隆，以质粒通用引物进行菌落PCR 扩增，扩增产物（大于1 200 bp）用限制性内切酶HaeⅢ 进行插入目的片段的RFLP分析，挑选酶切带谱不同的克隆（共118个）送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序部测序。将测序结果去除嵌合序列，并排除重复序列后共得到14个OTUs（代表105个有效序列）。根据公式，计算出克隆文库的覆盖率C为97.1%，可以代表野生秦嶺羚牛瘤胃产甲烷古菌的多样性。
2.3产甲烷古菌16S rRNA系统发育分析
选取不同酶切带谱对应的阳性克隆进行测序，根据序列比对结果可将105个阳性克隆（去除嵌合体和重复序列）归为14个OTUs。序列比对结果表明，这些序列均位于广域古菌门（Euryarchaeota），分属于Methanobacteriaceae、Methanomassiliicoccus和Methanosarcinaceae 3个科。54.29% （代表57个序列）的序列与可培养菌相似度在97%以上，分属于Methanobrevibacter millerae（42个序列）、Methanobrevibacter olleyae（12个序列）和Methanobrevibacter thaueri（3个序列），相似度从99.00%到96.91%不等。另有48个序列与未培养菌相似度较高（与已培养菌的序列比对相似度低于未培养菌），分属11个OTUs，其中1个OTUs（DQ445723）所占比例最高（33.33%，代表16个序列），这16个序列与DQ445723的相似度从97.27%到97.02%不等。在所有序列（105个序列）中，77个序列的比对结果相似度在97%以上，占总序列的73.33%（表1）。
根据产甲烷古菌16S rRNA序列构建的系统发育树见图2。由图2可知，系统发育树共分为3支，其中一支与甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）聚在一起，未培养古菌G53和G98也聚在这一支；另一支为未培养古菌，未能确定种属；G16单独一支，与甲烷食甲基菌属（Methanomethylovorans）聚在一起，代表可能有新的操作分类单元。
3结论与讨论
该研究获得了野生秦岭羚牛瘤胃产甲烷古菌的16S rRNA序列，序列比对结果表明甲烷短杆菌属为最优势菌群，占总克隆的54.29%，与裴彩霞等[9]的山羊瘤胃产甲烷杆菌的研究结果相一致[9]。克隆中有48个序列与未培养菌相似度较高，占11个OTUs，未能确定种属；另有一个OTUs在发育树中形成独立分支。
综合比较目前的研究报道发现，许多研究出现相同试验对象，不同试验所获得的瘤胃产甲烷菌的多样性不同，笔者认为其结果主要是由以下原因造成的：①引物的不同造成克隆多样性的不同。目前对瘤胃产甲烷菌的分子多样性的研究对象主要有山羊[9，14]、绵羊[15-16]和奶牛[17-18]等。Tajima等[6]对荷斯坦奶牛瘤胃产甲烷菌的多样性进行探究，结果表明引物0025cF/1429R较引物D30/D33探测到的产甲烷菌多样性多。裴彩霞等[9]研究表明引物Met86F和Met1340R 克隆比其他2对引物（1Af/1100Ar和Archf364/Archr1386）较为全面。引物的不同导致克隆多样性也有所区别。引物退火温度及扩增效率的不同，引物结合部位周围的结构以及不同扩增模板的特性都会导致不同引物优先扩增的菌群不同，因而造成多样性的差异。因此，对于羚牛瘤胃产甲烷古菌的多样性，还需用不同引物进行研究。②动物所采食日粮的不同，造成瘤胃内微生物的组成不同[15，19]。日粮可能通过影响瘤胃发酵类型等因素对瘤胃微生物多样性和数量产生影响。该试验中羚牛是在陕西佛坪自然保护区内自然放牧，取得瘤胃内容物的时间是冬季，其野生状态及取样时间同样是影响其瘤胃内产甲烷菌多样性的重要因素。
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