论文部分内容阅读
【摘要】 目的：研究TRAIL联合顺铂对卵巢癌耐药细胞COC1/DDP生长的影响，以及联合用药对TRAIL死亡受体（DR4、DR5）、凋亡相关基因Smac、Survivin表达的影响，揭示TRAIL联合顺铂可能逆转COC1/DDP细胞耐药性的机制。方法：采用MTT法检测不同浓度TRAIL蛋白与DDP联合用药对COC1/DDP细胞生长的影响，用Annexin V-FITC法检测COC1/DDP细胞凋亡，用RT-PCR方法检测DDP对TRAIL受体（DR4、DR5）、凋亡相关基因Smac、Survivin表达。结果：TRAIL蛋白对COC1/DDP细胞生长有抑制作用，DDP与TRAIL蛋白联合作用后细胞生长抑制率显著升高（P<0.05）。DDP使COC1/DDP细胞的DR5表达水平显著增强，为正常对照组的3.45倍（P<0.001）；Smac表达为对照组的2.82倍（P<0.001）；DR4水平无明显变化；Survivin表达较对照组显著减少（P<0.001）。结论：TRAIL蛋白对COC1/DDP细胞生长有抑制作用，DDP与TRAIL联合增强了对COC1/DDP细胞生长抑制；TRAIL逆转COC1/DDP细胞对DDP的耐药性可能与DDP导致TRAIL受体DR5水平升高、Smac表达增加，通过线粒体途径促进了肿瘤细胞的凋亡有关。
【关键词】 卵巢癌； 耐药性； TRAIL； 凋亡机制
【Abstract】 Objective：To investigate the effect of TRAIL combined with Cisplatin on the growth of ovarian cancer resistant COC1/DDP cells，and the effect of drug combination on the expression of TRAIL death receptors（DR4，DR5） and the apoptosis related genes Smac and Survivin.Method：The effects of different concentrations of TRAIL protein combined with DDP on the growth inhibition of COC1/DDP cells were detected by the MTT assay.Apoptosis of COC1/DDP cells was detected by V-FITC Annexin method.The expression of TRAIL death receptors（DR4，DR5） and the apoptosis related genes Smac，Survivin after treated with DDP were studied by RT-PCR technique.Result：TRAIL protein inhibited the growth of COC1/DDP cells，and the inhibition rate of DDP and TRAIL protein was significantly increased（P<0.05）.The COC1/DDP cell expression level of DR5 significantly enhanced as the control group of 3.45 times（P<0.001）.The expression of Smac for the control group of 2.82 times（P<0.001）.DR4 level without obvious change.Survivin expression compared with the control group decreased significantly（P<0.001）.Conclusion：TRAIL protein inhibited the growth of COC1/DDP cells，and the combination of DDP and TRAIL enhanced the inhibition of COC1/DDP
cells.TRAIL reversing the drug resistance of COC1/DDP cells to DDP may cause by the increase of TRAIL receptor DR5 and Smac expression，and promote the apoptosis of tumor cells through the mitochondrial pathway.
【Key words】 Ovarian cancer； Drug resistance； TRAIL； Apoptotic mechanism
First-author’s address：The People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350004，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.29.005
卵巢癌病死率居女性生殖道恶性肿瘤之首，约有70%患者发现时已是晚期，而其中绝大多数在手术后的化疗过程中又极易产生耐药，导致卵巢癌5年生存率仅为30%[1]。寻找逆转卵巢癌耐药化疗敏感性的药物并研究其机制，是现阶段卵巢癌治疗临床和基础研究的热点。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）是新发现的TNF超家族成员，与其受体结合后可特异性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞几乎无毒性，现已受到人们的广泛关注[2-5]。TRAIL与靶细胞表面的死亡受体DR4/DR5特异结合形成DR4/DR5-FADD-procaspase-8死亡诱导信号复合物（DISC），促使procaspase-8自我裂解形成有活性的凋亡起始蛋白caspase-8，进而活化效应蛋白，最终导致细胞凋亡[6-7]。本研究检测TRAIL对COC1/DDP细胞TRAIL死亡受体（DR4、DR5）、凋亡相关基因Smac、Survivin表达的影响，旨在探讨TRAIL联合顺铂可能逆转COC1/DDP细胞耐药性的机制，现报道如下。 1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 细胞株COC1/DDP 细胞由福建医科大学肿瘤实验室提供。
1.1.2 主要试剂 重组TRAIL蛋白为Pepro Tech公司产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）系美国Sigma公司产品。DD为山东齐鲁制药厂产品。酶联分析仪为美国VICTOR1420型多标记计数仪；逆转录试剂盒、Taq酶、DNAmarker总RNA提取试剂（Trizol）购自Invitrogin公司。引物由上海生工生物有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 COC1/DDP细胞采用含10%胎牛血清、1%双抗（青链霉素混合液）的RMPI-1640培养液，置于37 ℃、5%CO2及20%O2的培养箱中进行培养。
1.2.2 TRAIL蛋白和顺铂对细胞生长抑制检测 （1）检测不同浓度TRAIL对COC1/DDP细胞生长的影响：分别取对数生长期的COC1/DDP细胞以每孔1×104个/mL接种于96孔板24 h贴壁后，更新培养液并加入TRAIL蛋白液使终浓度为5、10、20、50、100、150 μg/L，每个浓度5个复孔，另设对照组（同体积的PBS）、空白组（加培养液，不含细胞及药物）；加药后分别继续在培养箱中作用12、24、36、48、60 h后取板备测。采用MTT法测定细胞的吸光度A490值，计算细胞生长抑制率。（2）求得IC50及最佳作用时间。（3）检测DDP与接近IC50的三个浓度TRAIL蛋白联合作用对COC1/DDP细胞生长的影响：分别取对数生长期COC1/DDP细胞接种于96孔培养板中，培养24 h后加入含有
2 μg/mL DDP和接近IC50的三个浓度TRAIL蛋白的培养液， 每一处理组设5个复孔，另设对照组、空白调零组，培养24 h后取板备测。测定每孔细胞的A490值，计算细胞生长抑制率。
1.2.3 采用Annexin V-FITC方法检测COC1/DDP细胞凋亡 COC1/DDP细胞接种于6孔板培养24 h贴壁后加DDP及TRAIL蛋白，分对照组（PBS代替
TRAIL蛋白、DDP）﹑DDP 2 μg/mL组、DDP 2 μg/mL
+TRAIL 40 μg/L组﹑DDP 2 μg/mL+TRAIL 60 μg/L组、
DDP 2 μg/mL+TRAIL 80 μg/L组，各组均设5个复孔，药物作用24h后按试剂盒流程加入Annexin V-FITC及碘化丙锭溶液（PI），流式细胞仪上分析。判断标准：横坐标是PI，纵坐标是Annixin V-FITC，左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细胞，左下象限是存活的细胞，左上象限即FITC（+）/PI（-）是凋亡的细胞。
1.2.4 RT-PCR方法检测COC1/DDP细胞DR4、DR5、Smac及Survivin表达 对数生长的COC1/DDP细胞分对照组（PBS代替）、DDP 0.5μg/mL组、DDP 1μg/mL组及DDP 2μg/mL组，分别培养
24 h后，按试剂盒流程提取总mRNA、cDNA合成及PCR反应。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。引物序列：DR4（上游：5’-ACG AAC GCT CTG GGA CCT GTA AC-3’、下游：5’-ATG TCC TAT GCC TAG TTC TTG TTG-3’）、DR5（上游：5’-TGA GCG GGA AGA GGA CAT GA-3’、下游：5’-GGC TAT TGC CAT TGT GAT TTG A-3’）、Smac（上游：5’-ACC GCC CAC TAC TCT TCC TC-3’下游：5’-GCG ATG CAT TAG GAG CCG TG-3’）及Survivin（上游：
5’-ATG CTG ATC GGA AGA CGC AA-3’下游：
5’-GCG GAT CTG TTT TCT CTG AT-3’），条带的大小分别为DR4 480 bp、DR5 445 bp、Smac 360 bp及Survivin 390 bp。
1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件包，各组资料的比较行方差齐性检验，方差齐者用多组计量资料的方差分析进行比较，两组资料比较用成组设计的t检验进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度TRAIL蛋白对COC1/DDP细胞生长的影响 由图1可见，TRAIL蛋白对COC1/DDP细胞的杀伤抑制作用随药物浓度的增加而增强；在同一药物浓度干预下，杀伤抑制作用随干预时间的延长而渐增；呈剂量-时间双效应关系。
2.2 DDP与不同浓度的TRAIL蛋白联合作用对COC1/DDP细胞生长的影响 选用接近IC50的三个浓度作为实验浓度：40、60、80 μg/L，以24 h为干预时间。单独DDP（2 μg/mL）作用COC1/DDP细胞24 h，抑制率为3.58%，见表1。提示COC1/DDP细胞对顺铂呈耐药状态，联合用药的抑制率明显高于同一浓度单纯TRAIL和DDP抑制率之和，提示TRAIL蛋白与DDP联合用药对COC1/DDP细胞可能有协同抑制增殖作用。
2.3 流式细胞仪Annexin V-FITC法检测细胞凋亡结果 如图2～6所示，随着与DDP联合的TRAIL浓度增加，COC1/DDP细胞凋亡率也逐渐上升，联合用药干预后凋亡率分别为（7.5±1.2）、（16.5±1.6）及（25.6±2.1）%，与单纯TRAIL蛋白作用比较，凋亡率均明显增加，且各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.4 RT-PCR检测COC1/DDP细胞DR4、DR5、Smac及Survivin表达 以DR4、DR5、Smac及Survivin基因扩增产物电泳带的吸光度，反映各自表达水平。如图7所示，从右向左条带分别代表对照组、DDP 0.5 μg/mL组、DDP 1 μg/mL组及DDP 2 μg/mL组。COC1/DDP细胞DR4水平对照组和DDP组表达均较低，且不同浓度DDP组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。DR5表达水平较对照组明显升高，DDP 2 μg/mL组为对照组的3.45倍（P<0.001）。Survivin表达均较对照组减少（P<0.001），且不同浓度DDP组间比较无明显差异（P>0.05）。Smac表达渐次增加，DDP 2 μg/mL组为对照组的2.82倍（P<0.001）。 3 讨论
肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL是TNF超家族的新成员。TRAIL通过与死亡受体（death receptor，DR）的功能受体DR4、DR5结合，能特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无明显毒性，与FasL和TNF-α对多种组织细胞有毒性相比，TRAIL在肿瘤治疗方面具有更好的应用前景[4-7]。目前普遍接受的TRAIL凋亡诱导途径有两条，即线粒体依赖型途径和线粒体非依赖型途径。I型为线粒体非依赖型途径，即活化的caspase-8直接激活下游效应蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-7而诱导凋亡。Ⅱ型为线粒体依赖型途径，活化的caspase-8促使Bid催化断裂形成有活性的截短Bid（tBid）并定位于线粒体膜，引起线粒体跨膜电位降低或破坏，促使线粒体释放细胞色素c、促凋亡蛋白Smac和dATP结合形成凋亡酶体（apoptosome），进而活化效应蛋白，最终导致细胞凋亡[8-14]。
本实验通过MTT法证实TRAIL蛋白可抑制COC1/DDP细胞生长，与DDP联合用药的抑制率高于同一浓度单纯TRAIL和DDP抑制率之和，提示两者联合对COC1/DDP细胞可能有协同抑制增殖作用。流式细胞仪Annexin V-FITC法检测细胞凋亡结果说明这种抑制作用部分源于两者的促凋亡作用。RT-PCR检测结果表明经过DDP处理后COC1/DDP细胞DR5表达增加，且可能通过线粒体途径中促凋亡蛋白Smac表达增加导致细胞凋亡。
COC1/DDP是将人卵巢浆液性腺癌细胞通过DDP浓度间歇诱导，最终获得能完全耐受1.0 μg/mL DDP的细胞亚株。由于TRAIL诱导细胞凋亡途径不同于DDP的作用机制，TRAIL是通过与细胞表面受体DR4和DR5结合引起肿瘤细胞凋亡，这与DDP、TXAL等常规化疗药物作用机制完全不同[15-19]。Arts等[20]通过检测发现化疗后残瘤肿瘤组织中DR4、DR5的表达较化疗前更强，认为这种变化可能是因化疗引起。本研究结果表明在2 μg/mL的DDP作用下COC1/DDP细胞抑制率仅为3.58%，提示对DDP耐药，联合用药的抑制率明显增加，高于同一浓度单纯TRAIL和DDP抑制率之和。DDP处理后DR5水平增加，会明显增强TRAIL促凋亡的作用，可以用来解释TRAIL可能逆转COC1/DDP细胞对DDP的耐药性。Survivin通过抑制caspase-3的表达而阻止细胞过度凋亡，本研究中DDP处理后Survivin表达减少，是否可能导致caspase-3的表达增加进而促进细胞，尚需进一步实验予以证实。Smac是存在于线粒体中并调节细胞凋亡的蛋白质，本研究中DDP处理后，Smac表达增加，推测DDP处理后COC1/DDP细胞DR5表达增加，可能通过线粒体途径导致细胞凋亡。
参考文献
[1] Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010[J].CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.
[2] Pitti R M，Marsters S A，Ruppert S，et al.Induction of apoptosis by Apo-2 ligand， a new member of the tumor necrosis factor cytokine family[J].Biol Chem，1996，271（22）：
12 687-12 690.
[3] Tecchio C，Huber V，Scapini P，et al.IFN-stimulated neutrophils and monocytes release a soluble form of TNF-related apoptosis-inducing ligand （TRAIL/Apo-2 ligand） displaying apoptotic activity on leukemic cells[J].Blood，2004，103（10）：3837-3844.
[4] Lane D，Cartier A，Rancourt C，et al.Cell detachment modulates TRAIL resistance in ovarian cancer cells by downregulating the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway[J].Int J Gynecol Cancer，2008，18（4）：670-676.
[5] Matei D，Fang F，Shen C，et al.Epigenetic resensitization to platinum in ovarian cancer[J].Cancer Res，2012，72（72）：2197-2205.
[6] Jo M，Kim T H，Seol D W，et al.Apoptosis induced in normal human hepatocytes by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand[J].Nat Med，2000，6（5）：564-567.
[7] Pritzker L B，Scatena M，Giachelli C M.The role of osteoprotegerin and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in human microvascular endothelial cell survival[J].Mol Biol Cell，2004，15（6）：2834-2841. [8] Wang F，Zhou J，Xie X，et al.Involvement of SRPK1 in cisplatin resistance related to long non-coding RNA UCA1 in human ovarian cancer cells[J].Neoplasma，2015，62（3）：432-438.
[9] Wen L，Hong D，Yanyin W，et al.Effect of tamoxifen，methoxyprogesterone acetate and combined treatment on cellular proliferation and apoptosis in SKOV3/DDP cells via the regulation of vascular endothelial growth factor[J].Arch Gynecol Obstet，2013，287（5）：997-1004.
[10] Sun Y，Liu J H，Jin L，et al.Effect of autophagy-related beclin1 on sensitivity of cisplatin-resistant ovarian cancer cells to chemotherapeutic agents[J].Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（7）：2785-2791.
[11] Zhao W J，Deng B Y，Wang X M，et al.XIAP associated factor 1（XAF1） represses expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein（XIAP） and regulates invasion，cell cycle，apoptosis，and cisplatin sensitivity of ovarian carcinoma cells[J].Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（6）：2453-2458.
[12] He J，Yu J J，Xu Q，et al.Downregulation of ATG14 by EGR1-MIR152 sensitizes ovarian cancer cells to cisplatin-induced apoptosis by inhibiting cyto-protective autophagy[J].Autophagy，2015，11（2）：373-384.
[13] Gu J，Tang Y，Liu Y，et al.Murine double minute 2 siRNA and wild-type p53 gene therapy enhances sensitivity of the SKOV3/DDP ovarian cancer cell line to cisplatin chemotherapy in vitro and in vivo[J].Cancer Lett，2014，343（2）：200-209.
[14] Kim M G，Pak J H，Choi W H，et al.The relationship between cisplatin resistance and histone deacetylase isoform over expression in epithelial ovarian cancer cell lines[J].J Gynecol Oncol，2012，23（3）：182-189.
[15] Chu S H，Liu Y W，Zhang L，et al.Regulation of survival and chemoresistance by HSP90AA1 in ovarian cancer SKOV3 cells[J].Mol Biol Rep，2013，40（1）：1-6.
[16] Ma S，Tan W，Du B，et al.Oridonin effectively reverses cisplatin drug resistance in human ovarian cancer cells via induction of cell apoptosis and inhibition of matrix metal loproteinase expression[J].Mol Med Rep，2016，13（4）：3342-3348.
[17] Guo P，Peng D，Xiong X，et al.Expression of micro RNA-100 and its correlation with drug resistance in human ovarian cancer SKOV3/DDP cells[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2015，35（11）：1624-1627.
[18] Xie D，Yin R T，Li K M，et al.Effects of hyperthermia combined platinum-based drugs on ovarian cancer cell lines SKOV3[J].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2014，45（4）：606-611.
[19] Zhao Y，Li Q，Wu X，et al.Upregulation of p27Kip1 by demethylation sensitizes cisplatin resistant human ovarian cancer SKOV3 cells[J].Mol Med Rep，2016，14（2）：1659-1666.
[20] Arts H J，de Jong S，Hollema H，et al.Chemotherapy induces death recept or 5 in epithelial ovarian carcinoma[J].Gynecol Oncol，2004，92（3）：794-800.
（收稿日期：2016-06-26） （本文编辑：程旭然）
【关键词】 卵巢癌； 耐药性； TRAIL； 凋亡机制
【Abstract】 Objective：To investigate the effect of TRAIL combined with Cisplatin on the growth of ovarian cancer resistant COC1/DDP cells，and the effect of drug combination on the expression of TRAIL death receptors（DR4，DR5） and the apoptosis related genes Smac and Survivin.Method：The effects of different concentrations of TRAIL protein combined with DDP on the growth inhibition of COC1/DDP cells were detected by the MTT assay.Apoptosis of COC1/DDP cells was detected by V-FITC Annexin method.The expression of TRAIL death receptors（DR4，DR5） and the apoptosis related genes Smac，Survivin after treated with DDP were studied by RT-PCR technique.Result：TRAIL protein inhibited the growth of COC1/DDP cells，and the inhibition rate of DDP and TRAIL protein was significantly increased（P<0.05）.The COC1/DDP cell expression level of DR5 significantly enhanced as the control group of 3.45 times（P<0.001）.The expression of Smac for the control group of 2.82 times（P<0.001）.DR4 level without obvious change.Survivin expression compared with the control group decreased significantly（P<0.001）.Conclusion：TRAIL protein inhibited the growth of COC1/DDP cells，and the combination of DDP and TRAIL enhanced the inhibition of COC1/DDP
cells.TRAIL reversing the drug resistance of COC1/DDP cells to DDP may cause by the increase of TRAIL receptor DR5 and Smac expression，and promote the apoptosis of tumor cells through the mitochondrial pathway.
【Key words】 Ovarian cancer； Drug resistance； TRAIL； Apoptotic mechanism
First-author’s address：The People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350004，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.29.005
卵巢癌病死率居女性生殖道恶性肿瘤之首，约有70%患者发现时已是晚期，而其中绝大多数在手术后的化疗过程中又极易产生耐药，导致卵巢癌5年生存率仅为30%[1]。寻找逆转卵巢癌耐药化疗敏感性的药物并研究其机制，是现阶段卵巢癌治疗临床和基础研究的热点。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）是新发现的TNF超家族成员，与其受体结合后可特异性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞几乎无毒性，现已受到人们的广泛关注[2-5]。TRAIL与靶细胞表面的死亡受体DR4/DR5特异结合形成DR4/DR5-FADD-procaspase-8死亡诱导信号复合物（DISC），促使procaspase-8自我裂解形成有活性的凋亡起始蛋白caspase-8，进而活化效应蛋白，最终导致细胞凋亡[6-7]。本研究检测TRAIL对COC1/DDP细胞TRAIL死亡受体（DR4、DR5）、凋亡相关基因Smac、Survivin表达的影响，旨在探讨TRAIL联合顺铂可能逆转COC1/DDP细胞耐药性的机制，现报道如下。 1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 细胞株COC1/DDP 细胞由福建医科大学肿瘤实验室提供。
1.1.2 主要试剂 重组TRAIL蛋白为Pepro Tech公司产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）系美国Sigma公司产品。DD为山东齐鲁制药厂产品。酶联分析仪为美国VICTOR1420型多标记计数仪；逆转录试剂盒、Taq酶、DNAmarker总RNA提取试剂（Trizol）购自Invitrogin公司。引物由上海生工生物有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 COC1/DDP细胞采用含10%胎牛血清、1%双抗（青链霉素混合液）的RMPI-1640培养液，置于37 ℃、5%CO2及20%O2的培养箱中进行培养。
1.2.2 TRAIL蛋白和顺铂对细胞生长抑制检测 （1）检测不同浓度TRAIL对COC1/DDP细胞生长的影响：分别取对数生长期的COC1/DDP细胞以每孔1×104个/mL接种于96孔板24 h贴壁后，更新培养液并加入TRAIL蛋白液使终浓度为5、10、20、50、100、150 μg/L，每个浓度5个复孔，另设对照组（同体积的PBS）、空白组（加培养液，不含细胞及药物）；加药后分别继续在培养箱中作用12、24、36、48、60 h后取板备测。采用MTT法测定细胞的吸光度A490值，计算细胞生长抑制率。（2）求得IC50及最佳作用时间。（3）检测DDP与接近IC50的三个浓度TRAIL蛋白联合作用对COC1/DDP细胞生长的影响：分别取对数生长期COC1/DDP细胞接种于96孔培养板中，培养24 h后加入含有
2 μg/mL DDP和接近IC50的三个浓度TRAIL蛋白的培养液， 每一处理组设5个复孔，另设对照组、空白调零组，培养24 h后取板备测。测定每孔细胞的A490值，计算细胞生长抑制率。
1.2.3 采用Annexin V-FITC方法检测COC1/DDP细胞凋亡 COC1/DDP细胞接种于6孔板培养24 h贴壁后加DDP及TRAIL蛋白，分对照组（PBS代替
TRAIL蛋白、DDP）﹑DDP 2 μg/mL组、DDP 2 μg/mL
+TRAIL 40 μg/L组﹑DDP 2 μg/mL+TRAIL 60 μg/L组、
DDP 2 μg/mL+TRAIL 80 μg/L组，各组均设5个复孔，药物作用24h后按试剂盒流程加入Annexin V-FITC及碘化丙锭溶液（PI），流式细胞仪上分析。判断标准：横坐标是PI，纵坐标是Annixin V-FITC，左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细胞，左下象限是存活的细胞，左上象限即FITC（+）/PI（-）是凋亡的细胞。
1.2.4 RT-PCR方法检测COC1/DDP细胞DR4、DR5、Smac及Survivin表达 对数生长的COC1/DDP细胞分对照组（PBS代替）、DDP 0.5μg/mL组、DDP 1μg/mL组及DDP 2μg/mL组，分别培养
24 h后，按试剂盒流程提取总mRNA、cDNA合成及PCR反应。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。引物序列：DR4（上游：5’-ACG AAC GCT CTG GGA CCT GTA AC-3’、下游：5’-ATG TCC TAT GCC TAG TTC TTG TTG-3’）、DR5（上游：5’-TGA GCG GGA AGA GGA CAT GA-3’、下游：5’-GGC TAT TGC CAT TGT GAT TTG A-3’）、Smac（上游：5’-ACC GCC CAC TAC TCT TCC TC-3’下游：5’-GCG ATG CAT TAG GAG CCG TG-3’）及Survivin（上游：
5’-ATG CTG ATC GGA AGA CGC AA-3’下游：
5’-GCG GAT CTG TTT TCT CTG AT-3’），条带的大小分别为DR4 480 bp、DR5 445 bp、Smac 360 bp及Survivin 390 bp。
1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件包，各组资料的比较行方差齐性检验，方差齐者用多组计量资料的方差分析进行比较，两组资料比较用成组设计的t检验进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度TRAIL蛋白对COC1/DDP细胞生长的影响 由图1可见，TRAIL蛋白对COC1/DDP细胞的杀伤抑制作用随药物浓度的增加而增强；在同一药物浓度干预下，杀伤抑制作用随干预时间的延长而渐增；呈剂量-时间双效应关系。
2.2 DDP与不同浓度的TRAIL蛋白联合作用对COC1/DDP细胞生长的影响 选用接近IC50的三个浓度作为实验浓度：40、60、80 μg/L，以24 h为干预时间。单独DDP（2 μg/mL）作用COC1/DDP细胞24 h，抑制率为3.58%，见表1。提示COC1/DDP细胞对顺铂呈耐药状态，联合用药的抑制率明显高于同一浓度单纯TRAIL和DDP抑制率之和，提示TRAIL蛋白与DDP联合用药对COC1/DDP细胞可能有协同抑制增殖作用。
2.3 流式细胞仪Annexin V-FITC法检测细胞凋亡结果 如图2～6所示，随着与DDP联合的TRAIL浓度增加，COC1/DDP细胞凋亡率也逐渐上升，联合用药干预后凋亡率分别为（7.5±1.2）、（16.5±1.6）及（25.6±2.1）%，与单纯TRAIL蛋白作用比较，凋亡率均明显增加，且各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.4 RT-PCR检测COC1/DDP细胞DR4、DR5、Smac及Survivin表达 以DR4、DR5、Smac及Survivin基因扩增产物电泳带的吸光度，反映各自表达水平。如图7所示，从右向左条带分别代表对照组、DDP 0.5 μg/mL组、DDP 1 μg/mL组及DDP 2 μg/mL组。COC1/DDP细胞DR4水平对照组和DDP组表达均较低，且不同浓度DDP组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。DR5表达水平较对照组明显升高，DDP 2 μg/mL组为对照组的3.45倍（P<0.001）。Survivin表达均较对照组减少（P<0.001），且不同浓度DDP组间比较无明显差异（P>0.05）。Smac表达渐次增加，DDP 2 μg/mL组为对照组的2.82倍（P<0.001）。 3 讨论
肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL是TNF超家族的新成员。TRAIL通过与死亡受体（death receptor，DR）的功能受体DR4、DR5结合，能特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无明显毒性，与FasL和TNF-α对多种组织细胞有毒性相比，TRAIL在肿瘤治疗方面具有更好的应用前景[4-7]。目前普遍接受的TRAIL凋亡诱导途径有两条，即线粒体依赖型途径和线粒体非依赖型途径。I型为线粒体非依赖型途径，即活化的caspase-8直接激活下游效应蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-7而诱导凋亡。Ⅱ型为线粒体依赖型途径，活化的caspase-8促使Bid催化断裂形成有活性的截短Bid（tBid）并定位于线粒体膜，引起线粒体跨膜电位降低或破坏，促使线粒体释放细胞色素c、促凋亡蛋白Smac和dATP结合形成凋亡酶体（apoptosome），进而活化效应蛋白，最终导致细胞凋亡[8-14]。
本实验通过MTT法证实TRAIL蛋白可抑制COC1/DDP细胞生长，与DDP联合用药的抑制率高于同一浓度单纯TRAIL和DDP抑制率之和，提示两者联合对COC1/DDP细胞可能有协同抑制增殖作用。流式细胞仪Annexin V-FITC法检测细胞凋亡结果说明这种抑制作用部分源于两者的促凋亡作用。RT-PCR检测结果表明经过DDP处理后COC1/DDP细胞DR5表达增加，且可能通过线粒体途径中促凋亡蛋白Smac表达增加导致细胞凋亡。
COC1/DDP是将人卵巢浆液性腺癌细胞通过DDP浓度间歇诱导，最终获得能完全耐受1.0 μg/mL DDP的细胞亚株。由于TRAIL诱导细胞凋亡途径不同于DDP的作用机制，TRAIL是通过与细胞表面受体DR4和DR5结合引起肿瘤细胞凋亡，这与DDP、TXAL等常规化疗药物作用机制完全不同[15-19]。Arts等[20]通过检测发现化疗后残瘤肿瘤组织中DR4、DR5的表达较化疗前更强，认为这种变化可能是因化疗引起。本研究结果表明在2 μg/mL的DDP作用下COC1/DDP细胞抑制率仅为3.58%，提示对DDP耐药，联合用药的抑制率明显增加，高于同一浓度单纯TRAIL和DDP抑制率之和。DDP处理后DR5水平增加，会明显增强TRAIL促凋亡的作用，可以用来解释TRAIL可能逆转COC1/DDP细胞对DDP的耐药性。Survivin通过抑制caspase-3的表达而阻止细胞过度凋亡，本研究中DDP处理后Survivin表达减少，是否可能导致caspase-3的表达增加进而促进细胞，尚需进一步实验予以证实。Smac是存在于线粒体中并调节细胞凋亡的蛋白质，本研究中DDP处理后，Smac表达增加，推测DDP处理后COC1/DDP细胞DR5表达增加，可能通过线粒体途径导致细胞凋亡。
参考文献
[1] Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010[J].CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.
[2] Pitti R M，Marsters S A，Ruppert S，et al.Induction of apoptosis by Apo-2 ligand， a new member of the tumor necrosis factor cytokine family[J].Biol Chem，1996，271（22）：
12 687-12 690.
[3] Tecchio C，Huber V，Scapini P，et al.IFN-stimulated neutrophils and monocytes release a soluble form of TNF-related apoptosis-inducing ligand （TRAIL/Apo-2 ligand） displaying apoptotic activity on leukemic cells[J].Blood，2004，103（10）：3837-3844.
[4] Lane D，Cartier A，Rancourt C，et al.Cell detachment modulates TRAIL resistance in ovarian cancer cells by downregulating the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway[J].Int J Gynecol Cancer，2008，18（4）：670-676.
[5] Matei D，Fang F，Shen C，et al.Epigenetic resensitization to platinum in ovarian cancer[J].Cancer Res，2012，72（72）：2197-2205.
[6] Jo M，Kim T H，Seol D W，et al.Apoptosis induced in normal human hepatocytes by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand[J].Nat Med，2000，6（5）：564-567.
[7] Pritzker L B，Scatena M，Giachelli C M.The role of osteoprotegerin and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in human microvascular endothelial cell survival[J].Mol Biol Cell，2004，15（6）：2834-2841. [8] Wang F，Zhou J，Xie X，et al.Involvement of SRPK1 in cisplatin resistance related to long non-coding RNA UCA1 in human ovarian cancer cells[J].Neoplasma，2015，62（3）：432-438.
[9] Wen L，Hong D，Yanyin W，et al.Effect of tamoxifen，methoxyprogesterone acetate and combined treatment on cellular proliferation and apoptosis in SKOV3/DDP cells via the regulation of vascular endothelial growth factor[J].Arch Gynecol Obstet，2013，287（5）：997-1004.
[10] Sun Y，Liu J H，Jin L，et al.Effect of autophagy-related beclin1 on sensitivity of cisplatin-resistant ovarian cancer cells to chemotherapeutic agents[J].Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（7）：2785-2791.
[11] Zhao W J，Deng B Y，Wang X M，et al.XIAP associated factor 1（XAF1） represses expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein（XIAP） and regulates invasion，cell cycle，apoptosis，and cisplatin sensitivity of ovarian carcinoma cells[J].Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（6）：2453-2458.
[12] He J，Yu J J，Xu Q，et al.Downregulation of ATG14 by EGR1-MIR152 sensitizes ovarian cancer cells to cisplatin-induced apoptosis by inhibiting cyto-protective autophagy[J].Autophagy，2015，11（2）：373-384.
[13] Gu J，Tang Y，Liu Y，et al.Murine double minute 2 siRNA and wild-type p53 gene therapy enhances sensitivity of the SKOV3/DDP ovarian cancer cell line to cisplatin chemotherapy in vitro and in vivo[J].Cancer Lett，2014，343（2）：200-209.
[14] Kim M G，Pak J H，Choi W H，et al.The relationship between cisplatin resistance and histone deacetylase isoform over expression in epithelial ovarian cancer cell lines[J].J Gynecol Oncol，2012，23（3）：182-189.
[15] Chu S H，Liu Y W，Zhang L，et al.Regulation of survival and chemoresistance by HSP90AA1 in ovarian cancer SKOV3 cells[J].Mol Biol Rep，2013，40（1）：1-6.
[16] Ma S，Tan W，Du B，et al.Oridonin effectively reverses cisplatin drug resistance in human ovarian cancer cells via induction of cell apoptosis and inhibition of matrix metal loproteinase expression[J].Mol Med Rep，2016，13（4）：3342-3348.
[17] Guo P，Peng D，Xiong X，et al.Expression of micro RNA-100 and its correlation with drug resistance in human ovarian cancer SKOV3/DDP cells[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2015，35（11）：1624-1627.
[18] Xie D，Yin R T，Li K M，et al.Effects of hyperthermia combined platinum-based drugs on ovarian cancer cell lines SKOV3[J].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2014，45（4）：606-611.
[19] Zhao Y，Li Q，Wu X，et al.Upregulation of p27Kip1 by demethylation sensitizes cisplatin resistant human ovarian cancer SKOV3 cells[J].Mol Med Rep，2016，14（2）：1659-1666.
[20] Arts H J，de Jong S，Hollema H，et al.Chemotherapy induces death recept or 5 in epithelial ovarian carcinoma[J].Gynecol Oncol，2004，92（3）：794-800.
（收稿日期：2016-06-26） （本文编辑：程旭然）