论文部分内容阅读
摘要：研究了软枣猕猴桃粗蛋白酶提取及对牛肉的嫩化效果，对酶用量、处理温度、处理时间对牛肉嫩化的影响进行了实验，并进一步通过L9（33）正交试验选择出最佳嫩化工艺并且通过测定其显微结构阐明其嫩化机制。结果表明：软枣猕猴桃粗蛋白酶的比活力为2098U/mg，对牛肉的剪切力、烹饪失水率和持水力均有影响，有较好的嫩化效果，通过正交试验确定软枣猕猴桃粗蛋白酶对牛肉嫩化的最佳工艺条件为酶用量0.05%、处理温度50℃、处理时间1.0h，影响因素次序为：处理温度>酶用量>处理时间，蛋白酶处理后的肉样和未处理的肉样相比肌原纤维直径变小，密度变大，小片化指数变大，其Z线断裂，肌间隙变大，肌间质增多，肌节长度变大，嫩度增加。
关键词：软枣猕猴桃粗蛋白酶；嫩化；牛肉；机制
中图分类号：TS202.3 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）07-0014-06
软枣猕猴桃（Actinidia arguta Planch.），属于猕猴桃科、猕猴桃属，为多年生落叶藤本植物，其果实具有较高的营养价值和经济价值[1]。软枣猕猴桃富含丰富的维生素和人体必需的矿物质及微量元素，尤其VC含量是其他水果的几倍至几十倍[2-3]，且其富含的有机酸及生物类黄酮，可保护VC不受氧化，使VC在肠道中发挥稳定的作用[4]。软枣猕猴桃对高血压、高血脂等症有一定的疗效，还有提高机体免疫力[5]、抗氧化、抗肿瘤、防治心脑血管疾病等生理功能，是理想的绿色食品和食疗食品[6-7]。
目前，对长白山野生软枣猕猴桃的研究仅涉及文献考证、分布状况、生物学特性调查、商品调查及组培、栽培等方面，无论从广度或深度上，与软枣猕猴桃所具有的价值相比是远远不够的。软枣猕猴桃蛋白酶是继木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等后发现的有待开发利用的新的植物蛋白酶[8-9]，植物蛋白酶在肌肉熟化过程中能有效地降解肌纤维与结蹄组织中的肌动球蛋白和弹性蛋白，使部分肽键断裂，生成游离氨基酸、羧基、羟基等亲水基团，肉料吸水膨胀，质地变嫩[10]。本实验从软枣猕猴桃中提取粗蛋白酶，并对牛肉的嫩化工艺及嫩化机制进行了研究，不仅开发了长白山野生资源，也扩展了植物蛋白酶的种类，为新型酶制剂在食品中的开发和应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
排酸牛肉 超市；长白山地区软枣猕猴桃于二道白河山区采摘；L-半胱氨酸、EDTA 美国Sigma公司；牛血清蛋白 北京奥博星生物技术有限公司；酪氨酸 国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
JEM-2100F投射电子显微镜、U-3900型紫外-可见分光光度计、GR-22G高速离心机 日本日立公司；TMS-PRO型质构仪 美国FTC公司；PHS-3C酸度计 上海佑科仪器仪表有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅 江苏国华电器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 软枣猕猴桃粗蛋白酶提取及测定
软枣猕猴桃汁50mL加入等体积含有0.1mol/L L-半胱氨酸和1mmol/L EDTA的溶液4℃条件下混匀2min，将混匀的溶液用灭菌的四层纱布过滤后在4℃条件下10000r/min离心20min，得到上清液在0～4℃条件下70%硫酸铵沉淀6h，得到的硫酸铵沉淀即为软枣猕猴桃粗蛋白酶，采用紫外分光光度法进行活力测定，并用于嫩化牛肉实验[11]。取沉淀粗酶1mL溶于99mL水，制得体积分数1%的原液。
1.3.2 牛肉嫩化处理
将牛肉剔除可见的结缔组织及脂肪，切成长宽高为3cm×3cm×3cm的方块，在不同条件下，用100mL软枣猕猴桃蛋白酶浸泡一段时间后，然后测定牛肉的剪切力、烹饪失水率及持水力，以确定牛肉最佳嫩化条件[12]。
1.3.3 试验设计
1.3.3.1 酶用量的影响
用体积分数1%的粗酶原液配制体积分数分别为0%、0.025%、0.050%、0.075%、0.100%的酶液各100mL，在室温下浸泡肉样1h，进行指标测定。
1.3.3.2 处理温度的影响
将肉样置于最佳体积分数酶液中，分别在25、37、50、60、70℃温度水浴中浸泡肉样1h，进行指标测定。
1.3.3.3 处理时间的影响
将肉样置于最佳体积分数酶液中，在最佳温度条件下分别水浴浸泡肉样0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，进行指标测定。
1.3.3.4 蛋白酶嫩化牛肉正交试验
采用L9（33）正交试验对酶用量、处理温度加处理时间三因素进行探讨，选择嫩化效果最佳的体积分数处理进行肌原纤维结构、小片化指数及超微结构测定。正交试验因素与水平见表1。
1.3.4 测定方法
1.3.4.1 蛋白酶浓度测定方法
采用考马斯亮蓝法测定[13]。
1.3.4.2 蛋白酶活力测定方法
采用紫外分光光度法测定[14]。蛋白酶溶液1.0mL与酪蛋白溶液5.0mL混合，置（37±0.2）℃水浴中反应10min，加三氯乙酸溶液终止反应，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在OD275nm处测定吸光度A；酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液顺序互换，其他操作相同，测定吸光度A0；另取酪氨酸对照溶液，以0.1mol/L盐酸溶液为空白，在OD275nm处测定吸光度An。
在上述条件下，每分钟水解酪蛋白生成1μg酪氨酸所需粗蛋白酶的量为1个酶活力单位。
1.3.4.3 烹饪失水率的测定
称取适量的牛肉放于蒸煮袋中，在95℃水浴锅中加热，当牛肉中心温度达到85℃时，取出样品，冷却至常温，用滤纸擦干表面水分，然后称质量 [15]。 1.3.4.4 持水力值的测定
用加热离心法测定持水力值，表示肌肉的保水性和嫩度。取样品10g绞碎后放入离心管中，82℃水浴加热20min，3000r/min离心20min后称质量。
1.3.4.5 剪切力值的测定
取适量大小的肉块放于蒸煮袋中，尽量排出袋内空气，将袋口扎紧，在80℃水浴锅中加热，当牛肉中心温度达到70℃时，将肉样取出冷却至中心温度为0～4℃，然后顺着肌纤维走向切取2cm×1.5cm×1.5cm的肉块，用质构仪测定剪切力[16]。
1.3.4.6 肌纤维结构测定[17]
取肌肉组织3cm×2cm×1cm，固定于甲醛溶液中，石蜡包埋常规切片（厚度6～8μm），木精-伊红染色（hematoxylin-eosin，HE）。每个样品制3片标本，用显微观察，并用显微图像分析仪测定以下指标：
1）肌纤维密度：在10×40倍光镜下，随机选5个视野，统计每个视野中肌纤维根数（n），求取平均肌纤维根数n后，按照n×400/64换算出1mm2的纤维数目即肌纤维密度（n/mm2）；2）肌纤维直径：测定每个视野下的肌原纤维密度后，将镜头转换为10×100倍高倍光镜下，用目测微尺随机测量20根肌纤维的直径，其平均值即为肌纤维直径/μm。
1.3.4.7 肌原纤维小片化指数（myofibrillar fagmentation index，MFI）的测定
MFI测定参考Olson等[18]的方法。2g肉样在20倍体积的缓冲液（100mmol/L KCl、20mmol/L PBS、pH7.1、1mmol/L EGTA、1mmol/L MgCl2、1mmol/L NaN3）中匀浆，1000×g离心15min；在沉淀中加入20倍体积的缓冲液，搅匀，重复离心1次；离心后沉淀加入5倍体积的缓冲液，搅匀、过滤；另用5倍体积的缓冲液对滤渣进行洗涤，将滤液蛋白质量浓度调至（0.5±0.05）mg/mL，测OD540nm值。OD540nm值乘以200即为肌原纤维小片化指数（MFI）。
1.3.4.8 肌原纤维超微结构测定
取正交试验最佳条件处理的样品为试验组，同样处理未加酶的样品为空白组，处理后取1mm×mm×1mm大小肉样（n=3），样品立即加入3%戊二醛中前固定2h，PBS缓冲液冲洗3次后用2%锇酸后固定2～3h，再次用PBS缓冲液冲洗，分别进行30%、50%、70%、80%、90%丙酮溶液脱水，每级作用30min，纯丙酮再作用3次，每次30min，然后进行包埋、聚合、切片、醋酸铀-柠檬酸铅双染色，最后用投射电镜观察、拍照。
2 结果与分析
2.1 软枣猕猴桃粗蛋白酶比活力
酪氨酸标准曲线如图1所示，以0.1mol/L盐酸溶液为空白。其回归方程y=0.0075x+0.0104，相关系数R2=0.9994。在酪氨酸质量浓度0～100μg/mL范围内，酪氨酸质量浓度与吸光度具有良好的线性关系。根据计算得出软枣猕猴桃粗蛋白酶的比活力为2098U/mg。
2.2 酶用量对软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉工艺的影响
由图2可以看出，随着酶用量的增加，软枣猕猴桃粗蛋白酶作用的强度也增加，牛肉的剪切力值逐渐降低，嫩度逐渐增加，但酶用量大于0.05%时，虽然牛肉剪切力很低，但嫩化过度造成牛肉蛋白质的过度降解，使其失去作为牛肉的食用价值和商品价值。由图3可以看出，酶用量为0.05%时，牛肉的持水力值最大，此时的剪切力值也较小，嫩化效果较好，但随着酶用量的增加，烹饪失水率变化很小，说明酶用量的增加对牛肉的烹饪失水率影响较小，综合分析酶用量对牛肉剪切力值、持水力值及烹饪失水率的影响，选择0.05%为软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的最佳用量。
2.3 反应温度对软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉效果的影响
由图4可以看出，随着反应温度的升高，牛肉的剪切力值逐渐降低，嫩度逐渐增加，温度在60℃和70℃时牛肉的剪切力值很低但其完整性破坏严重，其原因是酶作用过度，牛肉的肌纤维断裂，此时的剪切力值不能作为嫩度的指标，温度在50℃时，牛肉的完整性保持较好，因此认为50℃时的剪切力值为嫩度最低时的剪切力。由图5可以看出，反应温度为50℃时，牛肉的持水力值最大，烹饪失水率最低，然后随着温度升高，牛肉的持水力值降低，烹饪失水率增大，这是因为酶作用过度，牛肉的完整性受到破坏，处理后水分流出，持水力下降，烹饪失水率升高，因此综合分析反应温度对牛肉剪切力值、持水力值及烹饪失水率的影响，选择50℃为软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的最佳反应温度。
2.4 反应时间对软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉效果的影响
由图6可以看出，随着反应时间的延长，牛肉的剪切力值逐渐降低，嫩度逐渐增加。尽管在处理时间在2.0h和2.5h时牛肉的剪切力很低，但其完整性较差，原因与反应温度相似，此时剪切力值不能作为嫩度指标；处理时间在1.0h和1.5h时，剪切力值相差不大，但都比0.5h时的剪切力值降低较多，牛肉的完整性也较好。因此，剪切力值最低的处理时间为1.0～1.5h。由图7可以看出，处理时间过短或过长持水力值都较低，烹饪失水率都较高。这是因为处理时间过短时嫩化不够，时间过长时嫩化过度，在处理时间为1.0～1.5h时，牛肉的持水力值最大，烹饪失水率最低，与剪切力结果一致。因此选择最佳处理时间为1.0～1.5h。
2.5 软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的正交试验
在单因素试验的基础上采用L9（33）正交试验对酶用量、处理温度、处理时间进行探讨，以牛肉剪切力、烹饪失水率和持水力作为指标，来确定软枣猕猴桃粗蛋白酶最佳嫩化条件，正交试验结果及极差分析分别见表2和表3。
由表3可以看出，以牛肉剪切力和烹饪失水率为指标的影响因素主次顺序为：处理温度（B）>酶用量（A）>处理时间（C）；持水力值为指标的影响因素主次顺序为：酶用量（A）>处理时间（C）>处理温度（B）。由于嫩度的主要指标以剪切力为主，因此软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的影响最大的因素为处理温度，其次是酶用量，处理时间影响最小。分析得出最佳嫩化条件为A3B3C2或A2B2C1，但A3B3C2条件下嫩化的牛肉外观完整性较差，有肉末溶出，因此综合考虑选择A2B2C1为最佳嫩化条件，即酶用量0.05%。反应温度50℃，反应时间1.0h。感官评定也证明，在该条件下经软枣猕猴桃粗蛋白酶处理的牛肉，颜色较好，柔嫩多汁，口感明显改善。 2.6 软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的肌纤维结构及小片化变化
肌纤维是构成肌肉的基本单位，肌纤维的特性直接决定着肉质好坏，其直径的变化反映了肌纤维特性的变化[19]，肌纤维直径越细，肌纤维密度越大，肌肉质越细嫩[20]。肌原纤维小片化指数是反映肌原纤维及其骨架蛋白完整程度的指标，MFI越大，表明肌原纤维内部结构完整性受到破坏的程度越大[21-22]。
软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉肌纤维结构及MFI如表4所示，由表4可以看出，经软枣猕猴桃粗蛋白酶处理的肉样肌纤维直径小于对照组，肌纤维密度和MFI大于对照组，由此可以得出处理组的肉样得到了较好的嫩化效果。
2.7 软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的肌纤维超微结构变化
构成肌原纤维的粗丝和细丝排列在某一区域形成重叠，从而形成了显微镜下观察时所见的条纹即横纹。光线较暗的区域称为暗带（A-带），光线较亮的区域称为明带（Ⅰ-带），A带的中央有一条暗线称为M线，将A带分为左右两半，在M线附近有一颜色较浅的区域，称为H区，Ⅰ带的中央也有一条暗线，称为Z线，将Ⅰ带分为左右两半，两个相邻Z线间的肌原纤维称为肌节，肌节是肌原纤维的重复构造单元，也是肌肉收缩、松弛交替发生的基本单位[23]。
由图8可看出，未处理的牛肉肌原纤维完整，结构紧密有致，肌原纤维间隙、肌节长度均一，有序，Z线保持完好；而软枣猕猴桃粗蛋白酶处理后的牛肉Z线断裂，肌间隙变大，肌间质增多，肌节长度变大，这与测得的牛肉的剪切力降低，嫩度增大结果相吻合。
2.8 软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉机制
软枣猕猴桃粗蛋白酶将肌动球蛋白、肌球蛋白和肌动蛋白等肌原纤维蛋白降解成多肽等小分子物质，导致连接相邻骨骼肌的Z线断裂或消失，破坏了肌原纤维的完整性，变得松散，使肌原纤维直径变小，密度增大，小片化指数变大，界限模糊，肌间隙变大，肌间质增多，肌节变长，肌肉的剪切力降低，嫩度增大，这与肉质改善的根本原因是横纹肌肌原纤维小片化，肌肉纤维丧失完整性一致，符合蛋白酶的嫩肉原理，与生姜蛋白酶嫩化机制相似[24-25]。
3 结 论
3.1 经紫外分光光度法测定软枣猕猴桃粗蛋白酶比活力为2098U/mg；
3.2 通过正交试验得出软枣猕猴桃粗蛋白酶对牛肉的最佳嫩化条件为酶用量0.05%、处理温度50℃、处理时间1h，在此条件下，用软枣猕猴桃粗蛋白酶溶液对牛肉进行浸泡处理，可使牛肉的嫩度达到最佳效果，且和其他对照组相比，颜色较好，柔软多汁，有良好的弹性，牛肉品质得到显著提高；
3.3 软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的影响最大因素为处理温度，其次是酶用量，处理时间影响最小；
3.4 蛋白酶处理后的肉样和未处理的肉样相比肌原纤维直径变小，密度变大，小片化指数变大，其Z线断裂，肌间隙变大，肌间质增多，肌节长度变大，嫩度增加。
参考文献：
[1] 朴一龙， 赵兰花. 延边地区软枣猕猴桃资源分布和开发利用前景[J]. 延边大学农学学报， 2009， 31（1）： 32-35.
[2] 马月申， 袁福贵， 赵淑兰. 软枣猕猴桃果实营养成分的测定[J]. 特产研究， 1992（1）： 44-45.
[3] 王菲， 许金光， 刘长江. 软枣猕猴桃中的功能保健成分及其在食品加工中的应用[J]. 食品工业科技， 2010， 31（8）： 421-423.
[4] PARK Y H， CHUN E M， BEA M A， et al. Induction of apoptotic cell death in human Jurkat T cell by a chlorophyll derivative （Cp-D） isolated from Actinidia arguta planchon[J]. Journal of Microbiology and Biotechnoogy， 2000， 10（1）： 27-34.
[5] 史彩虹， 李大伟， 赵余庆. 软枣猕猴桃的化学成分和药理活性研究进展[J]. 现代药物与临床， 2011， 26（3）： 203-206.
[6] 祝德秋， 刘中申. 软枣猕猴桃抗衰老作用的研究[J]. 海南医学院学报， 1996， 2（2）： 54-57.
[7] 候芳玉， 孙延波， 陈飞， 等. 长白山产软枣猕猴桃茎多糖免疫药理作用的研究[J]. 中国中药杂志， 1995， 20（1）： 42-44.
[8] CAVIC M， GROZDANOVIC M， BAJIC A， et al. Actinidin， a protease from kiwifruit， induces changes in morphology and adhesion of T84 intestinal epithelial cells[J]. Phytochemistry， 2012， 77（6）： 46-52.
[9] 姜转宏. 猕猴桃产业演化发展探析[J]. 西北农林科技大学学报： 社会科学版， 2007， 7（2）： 109-112.
[10] 齐银霞， 成坚. 蛋白酶有限酶解对肉制品品质影响的研究进展[J]. 食品与机械， 2010， 26（2）： 162-165.
[11] GUAN H L， LIM H K， LEE C H， et al. Purification and characterization of a protease from Korean pear（Pyrus serotina L.） as meat tenderizer[J]. Food Science and Animal Resources， 2009， 29（2）：157-163. [12] 明建， 曾凯芳， 李洪军. 木瓜蛋白酶嫩化牛肉效果的研究[J]. 食品科学， 2009， 30（7）： 210-214.
[13] 王孝平， 刑树礼. 考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J]. 天津化工， 2009， 23（3）： 40-41.
[14] 欧英杰， 曾暖茜， 冯志强， 等. 紫外分光光度法对嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的测定方法研究[J]. 中国食品添加剂， 2010（2）： 214-216.
[15] 孙国梁， 孔凡敏， 刘涛， 等. 生姜蛋白酶嫩化牛肉效果的研究[J]. 食品工业科技， 2008（3）： 244-248.
[16] 王晓宇， 周光宏， 徐幸莲， 等. 猪肉剪切力的测定方法[J]. 食品科学， 2012， 33（21）： 64-67.
[17] 杨烨， 方桂友， 李忠荣， 等. 不同地方品种肉鸡肌原纤维组织学特性与肌肉嫩度的研究[J]. 安徽农业科学， 2009， 37（13）： 5987-5988.
[18] OLSON D G， PARRISH F C， STROMER M H. Myofibril fragmentation and shear resistance of three bovine muscles during postmortem storage[J]. Journal of Food Science， 1976， 41（5）： 1036-1041.
[19] 周光宏. 肉与肉制品加工学[M]. 北京： 中国农业科学技术出版社. 1999： 147-154.
[20] WIKLUND E， STEVENSON-BARRY J M， DUNCAN S J， et a1. Electrical stimulation of red deer （Cervus elaphus） carcasses-ellects on rate of pH-decline， meat tendemess， colour stability and water-holding acity[J]. Meat Science， 200l， 59（2）： 211-220.
[21] 黄明， 周光宏， 徐幸莲， 等. 不同注射处理对牛肉剪切力和肌原纤维小片化指数的影响[J]. 食品科学， 2005， 26（2）： 68-70.
[22] 谢婷. 钙蛋白酶及钙离子在猪肉宰后成熟过程中的作用研究[D]. 雅安： 四川农业大学， 2008.
[23] 白艳红， 德力格尔桑， 赵电波， 等. 超高压处理对绵羊肉嫩化机理的研究[J]. 农业工程学报， 2004， 20（6）： 6-10.
[24] LEE Y B， KIM Y S， ASHMORY C R. Antioxidant property in ginger rhizome and its application to meat products[J]. Journal of Food Science， 1986， 5l（1）： 20-23.
[25] 孙国梁， 孔凡敏， 刘涛， 等. 生姜蛋白酶嫩化牛肉效果的研究[J]. 食品工业科技， 2008， 29（3）： 244-248.
关键词：软枣猕猴桃粗蛋白酶；嫩化；牛肉；机制
中图分类号：TS202.3 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）07-0014-06
软枣猕猴桃（Actinidia arguta Planch.），属于猕猴桃科、猕猴桃属，为多年生落叶藤本植物，其果实具有较高的营养价值和经济价值[1]。软枣猕猴桃富含丰富的维生素和人体必需的矿物质及微量元素，尤其VC含量是其他水果的几倍至几十倍[2-3]，且其富含的有机酸及生物类黄酮，可保护VC不受氧化，使VC在肠道中发挥稳定的作用[4]。软枣猕猴桃对高血压、高血脂等症有一定的疗效，还有提高机体免疫力[5]、抗氧化、抗肿瘤、防治心脑血管疾病等生理功能，是理想的绿色食品和食疗食品[6-7]。
目前，对长白山野生软枣猕猴桃的研究仅涉及文献考证、分布状况、生物学特性调查、商品调查及组培、栽培等方面，无论从广度或深度上，与软枣猕猴桃所具有的价值相比是远远不够的。软枣猕猴桃蛋白酶是继木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等后发现的有待开发利用的新的植物蛋白酶[8-9]，植物蛋白酶在肌肉熟化过程中能有效地降解肌纤维与结蹄组织中的肌动球蛋白和弹性蛋白，使部分肽键断裂，生成游离氨基酸、羧基、羟基等亲水基团，肉料吸水膨胀，质地变嫩[10]。本实验从软枣猕猴桃中提取粗蛋白酶，并对牛肉的嫩化工艺及嫩化机制进行了研究，不仅开发了长白山野生资源，也扩展了植物蛋白酶的种类，为新型酶制剂在食品中的开发和应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
排酸牛肉 超市；长白山地区软枣猕猴桃于二道白河山区采摘；L-半胱氨酸、EDTA 美国Sigma公司；牛血清蛋白 北京奥博星生物技术有限公司；酪氨酸 国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
JEM-2100F投射电子显微镜、U-3900型紫外-可见分光光度计、GR-22G高速离心机 日本日立公司；TMS-PRO型质构仪 美国FTC公司；PHS-3C酸度计 上海佑科仪器仪表有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅 江苏国华电器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 软枣猕猴桃粗蛋白酶提取及测定
软枣猕猴桃汁50mL加入等体积含有0.1mol/L L-半胱氨酸和1mmol/L EDTA的溶液4℃条件下混匀2min，将混匀的溶液用灭菌的四层纱布过滤后在4℃条件下10000r/min离心20min，得到上清液在0～4℃条件下70%硫酸铵沉淀6h，得到的硫酸铵沉淀即为软枣猕猴桃粗蛋白酶，采用紫外分光光度法进行活力测定，并用于嫩化牛肉实验[11]。取沉淀粗酶1mL溶于99mL水，制得体积分数1%的原液。
1.3.2 牛肉嫩化处理
将牛肉剔除可见的结缔组织及脂肪，切成长宽高为3cm×3cm×3cm的方块，在不同条件下，用100mL软枣猕猴桃蛋白酶浸泡一段时间后，然后测定牛肉的剪切力、烹饪失水率及持水力，以确定牛肉最佳嫩化条件[12]。
1.3.3 试验设计
1.3.3.1 酶用量的影响
用体积分数1%的粗酶原液配制体积分数分别为0%、0.025%、0.050%、0.075%、0.100%的酶液各100mL，在室温下浸泡肉样1h，进行指标测定。
1.3.3.2 处理温度的影响
将肉样置于最佳体积分数酶液中，分别在25、37、50、60、70℃温度水浴中浸泡肉样1h，进行指标测定。
1.3.3.3 处理时间的影响
将肉样置于最佳体积分数酶液中，在最佳温度条件下分别水浴浸泡肉样0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，进行指标测定。
1.3.3.4 蛋白酶嫩化牛肉正交试验
采用L9（33）正交试验对酶用量、处理温度加处理时间三因素进行探讨，选择嫩化效果最佳的体积分数处理进行肌原纤维结构、小片化指数及超微结构测定。正交试验因素与水平见表1。
1.3.4 测定方法
1.3.4.1 蛋白酶浓度测定方法
采用考马斯亮蓝法测定[13]。
1.3.4.2 蛋白酶活力测定方法
采用紫外分光光度法测定[14]。蛋白酶溶液1.0mL与酪蛋白溶液5.0mL混合，置（37±0.2）℃水浴中反应10min，加三氯乙酸溶液终止反应，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在OD275nm处测定吸光度A；酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液顺序互换，其他操作相同，测定吸光度A0；另取酪氨酸对照溶液，以0.1mol/L盐酸溶液为空白，在OD275nm处测定吸光度An。
在上述条件下，每分钟水解酪蛋白生成1μg酪氨酸所需粗蛋白酶的量为1个酶活力单位。
1.3.4.3 烹饪失水率的测定
称取适量的牛肉放于蒸煮袋中，在95℃水浴锅中加热，当牛肉中心温度达到85℃时，取出样品，冷却至常温，用滤纸擦干表面水分，然后称质量 [15]。 1.3.4.4 持水力值的测定
用加热离心法测定持水力值，表示肌肉的保水性和嫩度。取样品10g绞碎后放入离心管中，82℃水浴加热20min，3000r/min离心20min后称质量。
1.3.4.5 剪切力值的测定
取适量大小的肉块放于蒸煮袋中，尽量排出袋内空气，将袋口扎紧，在80℃水浴锅中加热，当牛肉中心温度达到70℃时，将肉样取出冷却至中心温度为0～4℃，然后顺着肌纤维走向切取2cm×1.5cm×1.5cm的肉块，用质构仪测定剪切力[16]。
1.3.4.6 肌纤维结构测定[17]
取肌肉组织3cm×2cm×1cm，固定于甲醛溶液中，石蜡包埋常规切片（厚度6～8μm），木精-伊红染色（hematoxylin-eosin，HE）。每个样品制3片标本，用显微观察，并用显微图像分析仪测定以下指标：
1）肌纤维密度：在10×40倍光镜下，随机选5个视野，统计每个视野中肌纤维根数（n），求取平均肌纤维根数n后，按照n×400/64换算出1mm2的纤维数目即肌纤维密度（n/mm2）；2）肌纤维直径：测定每个视野下的肌原纤维密度后，将镜头转换为10×100倍高倍光镜下，用目测微尺随机测量20根肌纤维的直径，其平均值即为肌纤维直径/μm。
1.3.4.7 肌原纤维小片化指数（myofibrillar fagmentation index，MFI）的测定
MFI测定参考Olson等[18]的方法。2g肉样在20倍体积的缓冲液（100mmol/L KCl、20mmol/L PBS、pH7.1、1mmol/L EGTA、1mmol/L MgCl2、1mmol/L NaN3）中匀浆，1000×g离心15min；在沉淀中加入20倍体积的缓冲液，搅匀，重复离心1次；离心后沉淀加入5倍体积的缓冲液，搅匀、过滤；另用5倍体积的缓冲液对滤渣进行洗涤，将滤液蛋白质量浓度调至（0.5±0.05）mg/mL，测OD540nm值。OD540nm值乘以200即为肌原纤维小片化指数（MFI）。
1.3.4.8 肌原纤维超微结构测定
取正交试验最佳条件处理的样品为试验组，同样处理未加酶的样品为空白组，处理后取1mm×mm×1mm大小肉样（n=3），样品立即加入3%戊二醛中前固定2h，PBS缓冲液冲洗3次后用2%锇酸后固定2～3h，再次用PBS缓冲液冲洗，分别进行30%、50%、70%、80%、90%丙酮溶液脱水，每级作用30min，纯丙酮再作用3次，每次30min，然后进行包埋、聚合、切片、醋酸铀-柠檬酸铅双染色，最后用投射电镜观察、拍照。
2 结果与分析
2.1 软枣猕猴桃粗蛋白酶比活力
酪氨酸标准曲线如图1所示，以0.1mol/L盐酸溶液为空白。其回归方程y=0.0075x+0.0104，相关系数R2=0.9994。在酪氨酸质量浓度0～100μg/mL范围内，酪氨酸质量浓度与吸光度具有良好的线性关系。根据计算得出软枣猕猴桃粗蛋白酶的比活力为2098U/mg。
2.2 酶用量对软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉工艺的影响
由图2可以看出，随着酶用量的增加，软枣猕猴桃粗蛋白酶作用的强度也增加，牛肉的剪切力值逐渐降低，嫩度逐渐增加，但酶用量大于0.05%时，虽然牛肉剪切力很低，但嫩化过度造成牛肉蛋白质的过度降解，使其失去作为牛肉的食用价值和商品价值。由图3可以看出，酶用量为0.05%时，牛肉的持水力值最大，此时的剪切力值也较小，嫩化效果较好，但随着酶用量的增加，烹饪失水率变化很小，说明酶用量的增加对牛肉的烹饪失水率影响较小，综合分析酶用量对牛肉剪切力值、持水力值及烹饪失水率的影响，选择0.05%为软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的最佳用量。
2.3 反应温度对软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉效果的影响
由图4可以看出，随着反应温度的升高，牛肉的剪切力值逐渐降低，嫩度逐渐增加，温度在60℃和70℃时牛肉的剪切力值很低但其完整性破坏严重，其原因是酶作用过度，牛肉的肌纤维断裂，此时的剪切力值不能作为嫩度的指标，温度在50℃时，牛肉的完整性保持较好，因此认为50℃时的剪切力值为嫩度最低时的剪切力。由图5可以看出，反应温度为50℃时，牛肉的持水力值最大，烹饪失水率最低，然后随着温度升高，牛肉的持水力值降低，烹饪失水率增大，这是因为酶作用过度，牛肉的完整性受到破坏，处理后水分流出，持水力下降，烹饪失水率升高，因此综合分析反应温度对牛肉剪切力值、持水力值及烹饪失水率的影响，选择50℃为软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的最佳反应温度。
2.4 反应时间对软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉效果的影响
由图6可以看出，随着反应时间的延长，牛肉的剪切力值逐渐降低，嫩度逐渐增加。尽管在处理时间在2.0h和2.5h时牛肉的剪切力很低，但其完整性较差，原因与反应温度相似，此时剪切力值不能作为嫩度指标；处理时间在1.0h和1.5h时，剪切力值相差不大，但都比0.5h时的剪切力值降低较多，牛肉的完整性也较好。因此，剪切力值最低的处理时间为1.0～1.5h。由图7可以看出，处理时间过短或过长持水力值都较低，烹饪失水率都较高。这是因为处理时间过短时嫩化不够，时间过长时嫩化过度，在处理时间为1.0～1.5h时，牛肉的持水力值最大，烹饪失水率最低，与剪切力结果一致。因此选择最佳处理时间为1.0～1.5h。
2.5 软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的正交试验
在单因素试验的基础上采用L9（33）正交试验对酶用量、处理温度、处理时间进行探讨，以牛肉剪切力、烹饪失水率和持水力作为指标，来确定软枣猕猴桃粗蛋白酶最佳嫩化条件，正交试验结果及极差分析分别见表2和表3。
由表3可以看出，以牛肉剪切力和烹饪失水率为指标的影响因素主次顺序为：处理温度（B）>酶用量（A）>处理时间（C）；持水力值为指标的影响因素主次顺序为：酶用量（A）>处理时间（C）>处理温度（B）。由于嫩度的主要指标以剪切力为主，因此软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的影响最大的因素为处理温度，其次是酶用量，处理时间影响最小。分析得出最佳嫩化条件为A3B3C2或A2B2C1，但A3B3C2条件下嫩化的牛肉外观完整性较差，有肉末溶出，因此综合考虑选择A2B2C1为最佳嫩化条件，即酶用量0.05%。反应温度50℃，反应时间1.0h。感官评定也证明，在该条件下经软枣猕猴桃粗蛋白酶处理的牛肉，颜色较好，柔嫩多汁，口感明显改善。 2.6 软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的肌纤维结构及小片化变化
肌纤维是构成肌肉的基本单位，肌纤维的特性直接决定着肉质好坏，其直径的变化反映了肌纤维特性的变化[19]，肌纤维直径越细，肌纤维密度越大，肌肉质越细嫩[20]。肌原纤维小片化指数是反映肌原纤维及其骨架蛋白完整程度的指标，MFI越大，表明肌原纤维内部结构完整性受到破坏的程度越大[21-22]。
软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉肌纤维结构及MFI如表4所示，由表4可以看出，经软枣猕猴桃粗蛋白酶处理的肉样肌纤维直径小于对照组，肌纤维密度和MFI大于对照组，由此可以得出处理组的肉样得到了较好的嫩化效果。
2.7 软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的肌纤维超微结构变化
构成肌原纤维的粗丝和细丝排列在某一区域形成重叠，从而形成了显微镜下观察时所见的条纹即横纹。光线较暗的区域称为暗带（A-带），光线较亮的区域称为明带（Ⅰ-带），A带的中央有一条暗线称为M线，将A带分为左右两半，在M线附近有一颜色较浅的区域，称为H区，Ⅰ带的中央也有一条暗线，称为Z线，将Ⅰ带分为左右两半，两个相邻Z线间的肌原纤维称为肌节，肌节是肌原纤维的重复构造单元，也是肌肉收缩、松弛交替发生的基本单位[23]。
由图8可看出，未处理的牛肉肌原纤维完整，结构紧密有致，肌原纤维间隙、肌节长度均一，有序，Z线保持完好；而软枣猕猴桃粗蛋白酶处理后的牛肉Z线断裂，肌间隙变大，肌间质增多，肌节长度变大，这与测得的牛肉的剪切力降低，嫩度增大结果相吻合。
2.8 软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉机制
软枣猕猴桃粗蛋白酶将肌动球蛋白、肌球蛋白和肌动蛋白等肌原纤维蛋白降解成多肽等小分子物质，导致连接相邻骨骼肌的Z线断裂或消失，破坏了肌原纤维的完整性，变得松散，使肌原纤维直径变小，密度增大，小片化指数变大，界限模糊，肌间隙变大，肌间质增多，肌节变长，肌肉的剪切力降低，嫩度增大，这与肉质改善的根本原因是横纹肌肌原纤维小片化，肌肉纤维丧失完整性一致，符合蛋白酶的嫩肉原理，与生姜蛋白酶嫩化机制相似[24-25]。
3 结 论
3.1 经紫外分光光度法测定软枣猕猴桃粗蛋白酶比活力为2098U/mg；
3.2 通过正交试验得出软枣猕猴桃粗蛋白酶对牛肉的最佳嫩化条件为酶用量0.05%、处理温度50℃、处理时间1h，在此条件下，用软枣猕猴桃粗蛋白酶溶液对牛肉进行浸泡处理，可使牛肉的嫩度达到最佳效果，且和其他对照组相比，颜色较好，柔软多汁，有良好的弹性，牛肉品质得到显著提高；
3.3 软枣猕猴桃粗蛋白酶嫩化牛肉的影响最大因素为处理温度，其次是酶用量，处理时间影响最小；
3.4 蛋白酶处理后的肉样和未处理的肉样相比肌原纤维直径变小，密度变大，小片化指数变大，其Z线断裂，肌间隙变大，肌间质增多，肌节长度变大，嫩度增加。
参考文献：
[1] 朴一龙， 赵兰花. 延边地区软枣猕猴桃资源分布和开发利用前景[J]. 延边大学农学学报， 2009， 31（1）： 32-35.
[2] 马月申， 袁福贵， 赵淑兰. 软枣猕猴桃果实营养成分的测定[J]. 特产研究， 1992（1）： 44-45.
[3] 王菲， 许金光， 刘长江. 软枣猕猴桃中的功能保健成分及其在食品加工中的应用[J]. 食品工业科技， 2010， 31（8）： 421-423.
[4] PARK Y H， CHUN E M， BEA M A， et al. Induction of apoptotic cell death in human Jurkat T cell by a chlorophyll derivative （Cp-D） isolated from Actinidia arguta planchon[J]. Journal of Microbiology and Biotechnoogy， 2000， 10（1）： 27-34.
[5] 史彩虹， 李大伟， 赵余庆. 软枣猕猴桃的化学成分和药理活性研究进展[J]. 现代药物与临床， 2011， 26（3）： 203-206.
[6] 祝德秋， 刘中申. 软枣猕猴桃抗衰老作用的研究[J]. 海南医学院学报， 1996， 2（2）： 54-57.
[7] 候芳玉， 孙延波， 陈飞， 等. 长白山产软枣猕猴桃茎多糖免疫药理作用的研究[J]. 中国中药杂志， 1995， 20（1）： 42-44.
[8] CAVIC M， GROZDANOVIC M， BAJIC A， et al. Actinidin， a protease from kiwifruit， induces changes in morphology and adhesion of T84 intestinal epithelial cells[J]. Phytochemistry， 2012， 77（6）： 46-52.
[9] 姜转宏. 猕猴桃产业演化发展探析[J]. 西北农林科技大学学报： 社会科学版， 2007， 7（2）： 109-112.
[10] 齐银霞， 成坚. 蛋白酶有限酶解对肉制品品质影响的研究进展[J]. 食品与机械， 2010， 26（2）： 162-165.
[11] GUAN H L， LIM H K， LEE C H， et al. Purification and characterization of a protease from Korean pear（Pyrus serotina L.） as meat tenderizer[J]. Food Science and Animal Resources， 2009， 29（2）：157-163. [12] 明建， 曾凯芳， 李洪军. 木瓜蛋白酶嫩化牛肉效果的研究[J]. 食品科学， 2009， 30（7）： 210-214.
[13] 王孝平， 刑树礼. 考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J]. 天津化工， 2009， 23（3）： 40-41.
[14] 欧英杰， 曾暖茜， 冯志强， 等. 紫外分光光度法对嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的测定方法研究[J]. 中国食品添加剂， 2010（2）： 214-216.
[15] 孙国梁， 孔凡敏， 刘涛， 等. 生姜蛋白酶嫩化牛肉效果的研究[J]. 食品工业科技， 2008（3）： 244-248.
[16] 王晓宇， 周光宏， 徐幸莲， 等. 猪肉剪切力的测定方法[J]. 食品科学， 2012， 33（21）： 64-67.
[17] 杨烨， 方桂友， 李忠荣， 等. 不同地方品种肉鸡肌原纤维组织学特性与肌肉嫩度的研究[J]. 安徽农业科学， 2009， 37（13）： 5987-5988.
[18] OLSON D G， PARRISH F C， STROMER M H. Myofibril fragmentation and shear resistance of three bovine muscles during postmortem storage[J]. Journal of Food Science， 1976， 41（5）： 1036-1041.
[19] 周光宏. 肉与肉制品加工学[M]. 北京： 中国农业科学技术出版社. 1999： 147-154.
[20] WIKLUND E， STEVENSON-BARRY J M， DUNCAN S J， et a1. Electrical stimulation of red deer （Cervus elaphus） carcasses-ellects on rate of pH-decline， meat tendemess， colour stability and water-holding acity[J]. Meat Science， 200l， 59（2）： 211-220.
[21] 黄明， 周光宏， 徐幸莲， 等. 不同注射处理对牛肉剪切力和肌原纤维小片化指数的影响[J]. 食品科学， 2005， 26（2）： 68-70.
[22] 谢婷. 钙蛋白酶及钙离子在猪肉宰后成熟过程中的作用研究[D]. 雅安： 四川农业大学， 2008.
[23] 白艳红， 德力格尔桑， 赵电波， 等. 超高压处理对绵羊肉嫩化机理的研究[J]. 农业工程学报， 2004， 20（6）： 6-10.
[24] LEE Y B， KIM Y S， ASHMORY C R. Antioxidant property in ginger rhizome and its application to meat products[J]. Journal of Food Science， 1986， 5l（1）： 20-23.
[25] 孙国梁， 孔凡敏， 刘涛， 等. 生姜蛋白酶嫩化牛肉效果的研究[J]. 食品工业科技， 2008， 29（3）： 244-248.