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摘要：建立了采用高效液相色谱法同时测定牛奶中10种激素（可的松、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、曲安奈德、哈西奈德、醋酸泼尼松、醋酸氟氢可的松、雌酮、黄体酮）的分析方法。样品经乙腈处理沉淀蛋白质后取上清液浓缩，采用反相高效液相色谱法，以乙腈和水为流动相梯度洗脱。10种雌性激素分离效果良好，平均回收率范围80.7% ～95.1%，相对标准偏差为1.2% ～2.3%。
关键词：高效液相色谱法；牛奶；激素
牛奶是人们日常生活中喜爱的饮食之一，是最古老的天然饮料之一。喝牛奶的好处如今已越来越被大众所认识，牛奶中含有丰富的钙、维生素D等，包括人体生长发育所需的全部氨基酸，消化率高。但随着食用动物饲养过程中存在滥用抗生素、激素的现象，导致水产品、肉类、蛋类及乳类中存在抗生素和激素残留污染问题[1]。激素类残留污染主要是糖皮质激素残留污染、雌性激素污染和孕激素残留污染。过多摄入糖皮质激素可以引起水、盐、糖、蛋白质及脂肪代谢紊乱，表现为向心型肥胖、多毛、无力、低血钾、水肿、高血压和糖尿病等。长期食用含有雌性激素和孕激素得食品会严重影响人体得正常生理功能，更严重得会导致人体突变，具致畸性、致癌得潜在危害。动物生长过程中过量使用这些激素会导致其在动物源性食品中的残留，影响人类健康。因此，我国对动物源性食品中糖皮质激素和孕激素的最大残留量都做了规定。我国农业部文件《动物性食品中兽药最高残留限量》（ 农业部2002年235号公告）规定牛、猪、马的肌肉、肝脏和肾脏中的地塞米松最大残留量为0.75μg/kg，牛奶中地塞米松最大残留量为0.3μg/kg；牛、猪、马的肌肉和肾脏中的倍他米松最大残留量为0.75μg/kg，肝脏中的倍他米松最大残留量为2.0μg/kg，牛奶中倍他米松最大残留量为0.3μg/kg。农业部176号公告明确规定，禁止饲料和动物饮用水中添加炔诺醇、左炔诺孕酮、炔诺酮等孕激素，并在235 号公告规定了醋酸甲羟孕酮等外源性激素物质在动物性食品中的最高残留限量为不得检出。但迫于利益驱使，为提高奶牛产奶量，仍有养殖户非法使用糖皮质激素和孕激素，严重影响了人们的身体健康。
目前，对于激素类药物残留的检测方法已有很多，用于食品中激素残留检测的方法主要有液相色谱?质谱法（LC-MS）[2-3] 。但其前处理方法步骤较为繁琐，实验时间长、耗材消耗量大，且前处理中大量有害试剂对操作人员可能有危害风险。液相色谱-质谱方法消耗成本比较高，不适用于普遍推广。本文采用超高效液相色谱技术建立了同时测定牛奶中10种激素的分析方法，方法准确、简便、分析时间短、灵敏度高， 可应用于牛奶的实际检验工作。
1 试验部分
1.1 仪器与试剂
SHIMADZU-LC-20AT高效液相色谱仪，配SPD-20A紫外可见光检测器，SIL-20A自动进样器，日本岛津公司；超声波清洗器；离心机；0.45 μm过滤膜。
乙腈（色谱醇，德国Merck公司）；试验用水均为超纯水，标准品可的松、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、曲安奈德、哈西奈德、醋酸泼尼松、醋酸氟氢可的松、雌酮、黄体酮（中国食品药品检定研究院）。
1.2 标准溶液的配制
精确称取适量标准品，用甲醇配制成1.0mg/mL的标准储备液。分别取标准储备液用甲醇配制成质量浓度为100μg/mL 的混合标准工作液；用混合标准工作液配制系列标准溶液，激素质量浓度范围在0.05～100μg/mL 范围内。
1.3 样品的制备
准确量取样品10mL，置于25mL离心管中，加入10mL乙腈，涡旋提取1min，超声15min，用乙腈定容至刻度，9000r/min离心10min，取1mL 左右的上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定。
1.4 色谱条件
色谱柱为Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm ， 5 μm）色谱柱；柱温为27℃，流动相为乙腈（A）与水（B），梯度洗脱程序：
25% A 5min 28% A 5min 32% A 8min 38%A 7min 45% A 5min
52%A 8min 60%A 5min 25%A（2min）
流速为1.0 mL/min，进样量为10μL，检测波长为230 nm。
2 结果与讨论 2.1样品前处理 牛奶成分复杂，除水分外海含有蛋白质、脂肪和多种微量元素，其中蛋白质和脂肪是测定牛奶中激素的主要干扰物质，蛋白质和脂肪容易引起色谱柱柱压升高从而导致柱堵塞，也容易引起柱效的降低，本实验根据牛奶样品的特点和激素的化学性质，考察了甲醇，甲醇-乙腈（1：1，v/v），乙腈，乙酸乙酯三种溶液作为提取液来提取牛奶种的激素。结果表明，用乙腈来提取激素的同时可以沉淀蛋白质并且基本无杂质引入，所以本试验选择乙腈作为蛋白质沉淀剂和激素的提取剂。
2.2 检测波长的选择
本文查阅资料后采用紫外-可见分光光度计紫外范围进行扫描并用高效液相色谱进行验证。结果发现，糖皮质激素类化合物（可的松、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、曲安奈德、哈西奈德、醋酸泼尼松、醋酸氟氢可的松）的紫外吸收光谱相似，最大吸收波长在240nm处，雌酮的最大吸收波长在210nm处，黄体酮的最大吸收波长在254nm处。本试验考察了220、230、240、254nm条件下加标牛奶样品的出峰情况。结果表明，在230nm的条件下，各组分最为灵敏，故选择230nm处作为10种激素同时测定的波长。
2.3流动相的选择
在流动相的选择上，分别考察了甲醇-水和乙腈-水等流动相系统对于10种激素成分的分离效果， 结果表明， 采用乙腈-水系统进行梯度洗脱更有利于10种激素的色谱分离。标准色谱图如图1所示。
出峰顺序为：氢化可的松、可的松、倍他米松、地塞米松、曲安奈德、醋酸氟氢可的松、醋酸泼尼松、雌酮、哈西奈德、黄体酮。
2.4 标准曲线及检测限
将不同浓度的标准溶液分别进行测定，然后以峰面积为纵坐标，以各组分的含量为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程（见表1）。结果表明，该方法检测限低，线性范围广，相关系数良好。
2.5 分析结果的准确度及精密度
称取牛奶试样10mL ， 平行7份， 分别加入高、中、低三种浓度标准混合溶液， 充分混匀， 按照本实验方法进行测定， 10 种激素的平均回收率为80.7 %～95.1 %， 相对标准偏差为1.2 %～ 2.3%
2.6 样品的测定与分析
采用本法对市面上出售袋装牛奶进行了测定，未见有激素检出。
3. 结论
本方法以乙腈水为流动相梯度洗脱同时测定牛奶种10种激素， 分离效果好， 抗干扰能力强，方法简便。通过验证实验表明， 方法的精密度较好， 回收率高， 重现性好， 可以应用到牛奶中激素的实际检测。
参考文献
[1] 赵丹宇。食品中激素类、抗生素类物质得残留污染及管理【J】，中国食品卫生杂志，2003，15（1）：58-64
[2] 崔晓亮，邵兵，赵榕，孟娟，涂晓明。超高效液相色谱！串联电喷雾四极杆质谱法同时测定牛奶中12种糖皮质激素的残留【J】，色谱，2006，24（3）：213-217
关键词：高效液相色谱法；牛奶；激素
牛奶是人们日常生活中喜爱的饮食之一，是最古老的天然饮料之一。喝牛奶的好处如今已越来越被大众所认识，牛奶中含有丰富的钙、维生素D等，包括人体生长发育所需的全部氨基酸，消化率高。但随着食用动物饲养过程中存在滥用抗生素、激素的现象，导致水产品、肉类、蛋类及乳类中存在抗生素和激素残留污染问题[1]。激素类残留污染主要是糖皮质激素残留污染、雌性激素污染和孕激素残留污染。过多摄入糖皮质激素可以引起水、盐、糖、蛋白质及脂肪代谢紊乱，表现为向心型肥胖、多毛、无力、低血钾、水肿、高血压和糖尿病等。长期食用含有雌性激素和孕激素得食品会严重影响人体得正常生理功能，更严重得会导致人体突变，具致畸性、致癌得潜在危害。动物生长过程中过量使用这些激素会导致其在动物源性食品中的残留，影响人类健康。因此，我国对动物源性食品中糖皮质激素和孕激素的最大残留量都做了规定。我国农业部文件《动物性食品中兽药最高残留限量》（ 农业部2002年235号公告）规定牛、猪、马的肌肉、肝脏和肾脏中的地塞米松最大残留量为0.75μg/kg，牛奶中地塞米松最大残留量为0.3μg/kg；牛、猪、马的肌肉和肾脏中的倍他米松最大残留量为0.75μg/kg，肝脏中的倍他米松最大残留量为2.0μg/kg，牛奶中倍他米松最大残留量为0.3μg/kg。农业部176号公告明确规定，禁止饲料和动物饮用水中添加炔诺醇、左炔诺孕酮、炔诺酮等孕激素，并在235 号公告规定了醋酸甲羟孕酮等外源性激素物质在动物性食品中的最高残留限量为不得检出。但迫于利益驱使，为提高奶牛产奶量，仍有养殖户非法使用糖皮质激素和孕激素，严重影响了人们的身体健康。
目前，对于激素类药物残留的检测方法已有很多，用于食品中激素残留检测的方法主要有液相色谱?质谱法（LC-MS）[2-3] 。但其前处理方法步骤较为繁琐，实验时间长、耗材消耗量大，且前处理中大量有害试剂对操作人员可能有危害风险。液相色谱-质谱方法消耗成本比较高，不适用于普遍推广。本文采用超高效液相色谱技术建立了同时测定牛奶中10种激素的分析方法，方法准确、简便、分析时间短、灵敏度高， 可应用于牛奶的实际检验工作。
1 试验部分
1.1 仪器与试剂
SHIMADZU-LC-20AT高效液相色谱仪，配SPD-20A紫外可见光检测器，SIL-20A自动进样器，日本岛津公司；超声波清洗器；离心机；0.45 μm过滤膜。
乙腈（色谱醇，德国Merck公司）；试验用水均为超纯水，标准品可的松、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、曲安奈德、哈西奈德、醋酸泼尼松、醋酸氟氢可的松、雌酮、黄体酮（中国食品药品检定研究院）。
1.2 标准溶液的配制
精确称取适量标准品，用甲醇配制成1.0mg/mL的标准储备液。分别取标准储备液用甲醇配制成质量浓度为100μg/mL 的混合标准工作液；用混合标准工作液配制系列标准溶液，激素质量浓度范围在0.05～100μg/mL 范围内。
1.3 样品的制备
准确量取样品10mL，置于25mL离心管中，加入10mL乙腈，涡旋提取1min，超声15min，用乙腈定容至刻度，9000r/min离心10min，取1mL 左右的上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定。
1.4 色谱条件
色谱柱为Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm ， 5 μm）色谱柱；柱温为27℃，流动相为乙腈（A）与水（B），梯度洗脱程序：
25% A 5min 28% A 5min 32% A 8min 38%A 7min 45% A 5min
52%A 8min 60%A 5min 25%A（2min）
流速为1.0 mL/min，进样量为10μL，检测波长为230 nm。
2 结果与讨论 2.1样品前处理 牛奶成分复杂，除水分外海含有蛋白质、脂肪和多种微量元素，其中蛋白质和脂肪是测定牛奶中激素的主要干扰物质，蛋白质和脂肪容易引起色谱柱柱压升高从而导致柱堵塞，也容易引起柱效的降低，本实验根据牛奶样品的特点和激素的化学性质，考察了甲醇，甲醇-乙腈（1：1，v/v），乙腈，乙酸乙酯三种溶液作为提取液来提取牛奶种的激素。结果表明，用乙腈来提取激素的同时可以沉淀蛋白质并且基本无杂质引入，所以本试验选择乙腈作为蛋白质沉淀剂和激素的提取剂。
2.2 检测波长的选择
本文查阅资料后采用紫外-可见分光光度计紫外范围进行扫描并用高效液相色谱进行验证。结果发现，糖皮质激素类化合物（可的松、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、曲安奈德、哈西奈德、醋酸泼尼松、醋酸氟氢可的松）的紫外吸收光谱相似，最大吸收波长在240nm处，雌酮的最大吸收波长在210nm处，黄体酮的最大吸收波长在254nm处。本试验考察了220、230、240、254nm条件下加标牛奶样品的出峰情况。结果表明，在230nm的条件下，各组分最为灵敏，故选择230nm处作为10种激素同时测定的波长。
2.3流动相的选择
在流动相的选择上，分别考察了甲醇-水和乙腈-水等流动相系统对于10种激素成分的分离效果， 结果表明， 采用乙腈-水系统进行梯度洗脱更有利于10种激素的色谱分离。标准色谱图如图1所示。
出峰顺序为：氢化可的松、可的松、倍他米松、地塞米松、曲安奈德、醋酸氟氢可的松、醋酸泼尼松、雌酮、哈西奈德、黄体酮。
2.4 标准曲线及检测限
将不同浓度的标准溶液分别进行测定，然后以峰面积为纵坐标，以各组分的含量为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程（见表1）。结果表明，该方法检测限低，线性范围广，相关系数良好。
2.5 分析结果的准确度及精密度
称取牛奶试样10mL ， 平行7份， 分别加入高、中、低三种浓度标准混合溶液， 充分混匀， 按照本实验方法进行测定， 10 种激素的平均回收率为80.7 %～95.1 %， 相对标准偏差为1.2 %～ 2.3%
2.6 样品的测定与分析
采用本法对市面上出售袋装牛奶进行了测定，未见有激素检出。
3. 结论
本方法以乙腈水为流动相梯度洗脱同时测定牛奶种10种激素， 分离效果好， 抗干扰能力强，方法简便。通过验证实验表明， 方法的精密度较好， 回收率高， 重现性好， 可以应用到牛奶中激素的实际检测。
参考文献
[1] 赵丹宇。食品中激素类、抗生素类物质得残留污染及管理【J】，中国食品卫生杂志，2003，15（1）：58-64
[2] 崔晓亮，邵兵，赵榕，孟娟，涂晓明。超高效液相色谱！串联电喷雾四极杆质谱法同时测定牛奶中12种糖皮质激素的残留【J】，色谱，2006，24（3）：213-217