【摘 要】
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试验旨在筛选有效抑制猪紧密连接蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)基因表达的shRNA干扰片段,为后期利用RNA干扰技术深入了解ZO-1基因在猪卵母细胞成熟过程中的功能奠定基础。
【机 构】
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广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室
【基金项目】
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国家自然科学基金(31560632);广西自然科学基金项目(2012GXNSFCB053002,2014GXNSFAA118084);国家留学回国基金项目(BLH120499)
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试验旨在筛选有效抑制猪紧密连接蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)基因表达的shRNA干扰片段,为后期利用RNA干扰技术深入了解ZO-1基因在猪卵母细胞成熟过程中的功能奠定基础。本研究首先克隆了猪ZO-1基因,并构建了其真核表达载体,而后筛选了有效抑制ZO-1基因表达的shRNA干扰片段。结果表明,猪ZO-1基因编码区长度为3 036bp,多重序列比对结果显示,猪ZO-1基因核苷酸序列与牛、羊、马和人相应序列的同源性分别为88%、88%、87%和85%。构建的pDsRed-N1-ZO-1真核蛋白融合表达载体经脂质体法转染HEK293T细胞后,可观察到清晰的RFP红色荧光蛋白表达。将靶质粒与shRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞48h后,与对照组相比,可观察到红色荧光表达得到抑制。实时荧光定量PCR结果显示,设计合成的2条shRNA对猪ZO-1基因表达均有抑制效果,其中ZO-1shRNA201的抑制效果显著高于ZO-1shRNA1276(77.8%和67.0%,P<0.05)。
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