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一般认为，乙型肝炎发病机制为HBV感染人体后所引起的肝脏和其他脏器病变，以及疾病的发生发展，并非病毒本身所致，而是与人体的免疫状态有关，主要由变态反应引起。本研究从中医证型研究慢性乙型肝炎的免疫状态，为中医辨证治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象
研究病例来源于——的慢性乙型肝炎患者。其中湿热中阻型慢性乙型肝炎患者30例，非湿热中阻型慢性乙型肝炎患者30例。
1.2 病例选择
1.2.1 临床诊断标准
有乙型肝炎或HBsAg阳性史超过6个月，现HBsAg和（或）HBV-DNA仍为阳性者，可诊断为慢性HBV感染。
1.2.2 中医辩证标准
湿热中阻型：
主症：①身目发黄或无黄疸②胁肋胀痛③舌红、苔黄腻
次症：①小便发黄 ②口苦或口腻 ③脘闷腹胀 ④恶心呕吐
1.3 观察指标
（1）肝功能：ALT，AST，GGT，γ-GT ，ALP，TBIL，DBIL，A，G；；病毒学指标：HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb，HBV-DNA。
（2）T细胞亚群：CD3，CD4，CD8，NK等。
（3）外周血IL-4、IL-10、IFN-γ、PD-1。
1.4 实验方法：
1.4.1 实验室检测指标：
免疫学指标：CD3，CD4，CD8，CD56（流式细胞仪检测）；
外周血IL-4、IL-10、IFN-γ：采用用双抗体夹心EILSA法检测PBMC产生IL-4、IL-10和IFN-γ。
PD-1
HLA-A×02型别鉴定
研究对象各取100μl新鲜抗凝血加人流式检测管，加入2 ml红细胞裂解液反应12 min后离心，弃上清液，PBS洗细胞2次，其中反应管加入鼠抗人FITC标记的HLA—A×02抗体100μl，对照管加入FITC标记的同型抗体100μl，于4℃ 30 rain孵育后，PBS再次洗细胞，每管加人流式固定液200μl后于流式细胞仪检测。
外周血T淋巴细胞的分离
取研究对象新鲜抗凝外周血，以RPMI 1640不完全培养基l：l稀释，经密度梯度离心后取中间白膜层细胞，PBS洗细胞2次，加入红细胞裂解液，37℃温育5 rain后离心洗涤，收集单个核细胞（PBMCs）。部分PBMCs再用尼龙毛柱分离获取T淋巴细胞并计数，同时流式测定总CD+3T细胞比率在60% ～70% 。
细胞总RNA 的提取
每份标本取新鲜分离的T淋巴细胞或PBMCs（1×l06 个）加lmlTrizol，分离提取总RNA，污染的基因组DNA 通过RNase-Free的DNA酶去除，分光光度仪测定其浓度并经琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度后-80℃冻存备用。
相对荧光定量PCR检测PD-l
分子水平分离鉴定的总RNA经oliga（dT）引物和MMLV 逆转录反转成cDNA。取lμl纯化cDNA，加入含PD-l上下游引物和SYBR-green I Ex Taq酶的20μl反应体系中，于荧光定量PCR 仪进行扩增。循环程序为：95℃预变性30S；94℃变性l0S，60℃退火30S，72℃延伸40S，共40个循环；最后取5μl PCR产物进行l%琼脂糖凝胶电泳。所有样本的目的基因表达水平以同一样本的β-actin表达水平为基准调整样本间的差异，所有样本的PCR反应均设置3个复孔，结果取平均值。
1.5 数据处理及统计分析
应用SPSS16.0软件统计处理。计量资料用均数±标准差（X±SD）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析。P值小于或等于0.05具统计学意义。
2 结果
2.1 外周血T 淋巴细胞分析
2.2 细胞因子
3 讨论
本实验中湿热中阻型和非湿热中阻型IL-4、IL-10均较正常组高，IFN-γ较正常对照组低，提示慢乙肝细胞免疫有应答但受抑制Th1/Th2失平衡。湿热中阻型IFN-γ较高，提示湿热中阻型免疫反应剧烈。IFN-γ的分泌低下可能造成细胞免疫功能低下，从而难于清除HBV。慢性乙型病毒性肝炎Th2类细胞因子IL-10升高。其中非湿热中阻型升高更明显，且与湿热中阻型之间的差异显著。IL-10的升高可能作为一种拮抗因子下调IL-2、IFN-γ的表达，从而削弱机体的细胞免疫功能，不利于清除病毒，使HBV持续感染，同时又可抑制肝脏炎症反应，减轻肝损伤。非湿热中阻型较湿热中阻型IL-10升高更明显，提示非湿热中阻型患者更难于清除乙肝病毒，HBV的感染更易慢性化，但肝损程度较轻。
参考文献
[1] REHERMANN B， NASCIMBENI M.Im munology of hepatitis B virus and hepatitis Cvirus infection[J].Nat Rev Immunol，2005，5（3）：215—229.
[2] OKAZAKI T，WANG J.PD-1/PD-L pathway andAutoimmunity[J].Autoimmunity，2005，38（5）：353—357.
[3] BARBER D L，WHERRY E J，MASOPUST D，et a1.Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection [J].Nature，2006，439（7077）：682—687.
1 材料与方法
1.1 研究对象
研究病例来源于——的慢性乙型肝炎患者。其中湿热中阻型慢性乙型肝炎患者30例，非湿热中阻型慢性乙型肝炎患者30例。
1.2 病例选择
1.2.1 临床诊断标准
有乙型肝炎或HBsAg阳性史超过6个月，现HBsAg和（或）HBV-DNA仍为阳性者，可诊断为慢性HBV感染。
1.2.2 中医辩证标准
湿热中阻型：
主症：①身目发黄或无黄疸②胁肋胀痛③舌红、苔黄腻
次症：①小便发黄 ②口苦或口腻 ③脘闷腹胀 ④恶心呕吐
1.3 观察指标
（1）肝功能：ALT，AST，GGT，γ-GT ，ALP，TBIL，DBIL，A，G；；病毒学指标：HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb，HBV-DNA。
（2）T细胞亚群：CD3，CD4，CD8，NK等。
（3）外周血IL-4、IL-10、IFN-γ、PD-1。
1.4 实验方法：
1.4.1 实验室检测指标：
免疫学指标：CD3，CD4，CD8，CD56（流式细胞仪检测）；
外周血IL-4、IL-10、IFN-γ：采用用双抗体夹心EILSA法检测PBMC产生IL-4、IL-10和IFN-γ。
PD-1
HLA-A×02型别鉴定
研究对象各取100μl新鲜抗凝血加人流式检测管，加入2 ml红细胞裂解液反应12 min后离心，弃上清液，PBS洗细胞2次，其中反应管加入鼠抗人FITC标记的HLA—A×02抗体100μl，对照管加入FITC标记的同型抗体100μl，于4℃ 30 rain孵育后，PBS再次洗细胞，每管加人流式固定液200μl后于流式细胞仪检测。
外周血T淋巴细胞的分离
取研究对象新鲜抗凝外周血，以RPMI 1640不完全培养基l：l稀释，经密度梯度离心后取中间白膜层细胞，PBS洗细胞2次，加入红细胞裂解液，37℃温育5 rain后离心洗涤，收集单个核细胞（PBMCs）。部分PBMCs再用尼龙毛柱分离获取T淋巴细胞并计数，同时流式测定总CD+3T细胞比率在60% ～70% 。
细胞总RNA 的提取
每份标本取新鲜分离的T淋巴细胞或PBMCs（1×l06 个）加lmlTrizol，分离提取总RNA，污染的基因组DNA 通过RNase-Free的DNA酶去除，分光光度仪测定其浓度并经琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度后-80℃冻存备用。
相对荧光定量PCR检测PD-l
分子水平分离鉴定的总RNA经oliga（dT）引物和MMLV 逆转录反转成cDNA。取lμl纯化cDNA，加入含PD-l上下游引物和SYBR-green I Ex Taq酶的20μl反应体系中，于荧光定量PCR 仪进行扩增。循环程序为：95℃预变性30S；94℃变性l0S，60℃退火30S，72℃延伸40S，共40个循环；最后取5μl PCR产物进行l%琼脂糖凝胶电泳。所有样本的目的基因表达水平以同一样本的β-actin表达水平为基准调整样本间的差异，所有样本的PCR反应均设置3个复孔，结果取平均值。
1.5 数据处理及统计分析
应用SPSS16.0软件统计处理。计量资料用均数±标准差（X±SD）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析。P值小于或等于0.05具统计学意义。
2 结果
2.1 外周血T 淋巴细胞分析
2.2 细胞因子
3 讨论
本实验中湿热中阻型和非湿热中阻型IL-4、IL-10均较正常组高，IFN-γ较正常对照组低，提示慢乙肝细胞免疫有应答但受抑制Th1/Th2失平衡。湿热中阻型IFN-γ较高，提示湿热中阻型免疫反应剧烈。IFN-γ的分泌低下可能造成细胞免疫功能低下，从而难于清除HBV。慢性乙型病毒性肝炎Th2类细胞因子IL-10升高。其中非湿热中阻型升高更明显，且与湿热中阻型之间的差异显著。IL-10的升高可能作为一种拮抗因子下调IL-2、IFN-γ的表达，从而削弱机体的细胞免疫功能，不利于清除病毒，使HBV持续感染，同时又可抑制肝脏炎症反应，减轻肝损伤。非湿热中阻型较湿热中阻型IL-10升高更明显，提示非湿热中阻型患者更难于清除乙肝病毒，HBV的感染更易慢性化，但肝损程度较轻。
参考文献
[1] REHERMANN B， NASCIMBENI M.Im munology of hepatitis B virus and hepatitis Cvirus infection[J].Nat Rev Immunol，2005，5（3）：215—229.
[2] OKAZAKI T，WANG J.PD-1/PD-L pathway andAutoimmunity[J].Autoimmunity，2005，38（5）：353—357.
[3] BARBER D L，WHERRY E J，MASOPUST D，et a1.Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection [J].Nature，2006，439（7077）：682—687.