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摘要
本研究以在检疫中经常被截获的5种豆象为研究对象，通过对GenBank中5种豆象mtDNA COⅠ序列的查询，并进行序列比对，共设计了30对引物，通过筛选获得5对能分别鑒定5种豆象的特异引物，并用50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL 8个不同浓度系列的豆象DNA模板来检测灵敏度，结果表明，豌豆象和四纹豆象特异引物对的灵敏度为0.1 ng/μL，蚕豆象、菜豆象和绿豆象特异引物对的灵敏度为0.5 ng/μL。该方法可用于快速准确地鉴定5种豆象，对于豆象类害虫的检测监测具有重要意义。
关键词
豆象科；mtDNA COⅠ基因；特异引物；分子鉴定
中图分类号：
S 379
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.04.022
Abstract
Molecular identification of five bean weevils that were frequently intercepted from customs was studied in this paper. Based on the mtDNA COⅠ gene sequences of Callosobruchus chinensis， Bruchus rufimanus， B.pisorum， Acanthoscelides obtectus and C.maculatus from GenBank， 30 pairs of primers were designed， and the five bean weevils can be specifically identified by PCR amplification with five pairs of specific primers. Moreover， the sensitivity of PCR was detected at 50，25，10，5，1，0.5，0.1 and 0.05 ng/μL genomic DNA of C.chinensis， B.rufimanus， B.pisorum， A.obtectus and C.maculatus，respectively.The results showed that the sensitivity for B.pisorum and C.maculatus was 0.1 ng/μL， while 0.5 ng/μL for the other three. The method provides a rapid and reliable tool for identification of the five bean weevils， which could be applied in detecting and monitoring of bean weevil pests.
Key words
Bruchidae；mtDNA COⅠ gene；specific primers；molecular identification
豆象是豆象科昆虫的总称，分布于除南极之外的各大陆，尤其以亚洲的热带区以及中美和南美地区数量最多[1]。豆象科昆虫目前全世界记录约1 400种，分属于58个属[2]。该科昆虫大约有84%的种类取食豆科植物种子，成为栽培豆科植物的一类重要害虫[3]。1997年浙江宁海曾发生蚕豆象大规模为害，为害率高的达到80%以上，经济损失严重[4]。绿豆象严重为害绿豆、豇豆、鹰嘴豆、蚕豆和豌豆等多种豆类[56]，主要在仓内蛀食储藏的豆粒，造成的损失达30%以上[7]。我国共记载有18种储藏物中豆象科昆虫，其中绿豆象Callosobruchus chinensis、蚕豆象Bruchus rufimanus和豌豆象Bruchus pisorum为我国主要的储藏豆类害虫；而菜豆象Acanthoscelides obtectus和四纹豆象Callosobruchus maculatus为我国规定禁止入境的检疫性害虫[8]。
目前口岸检验检疫部门对豆象科昆虫的鉴定主要以成虫的外部形态特征作为鉴定依据，但本研究涉及的5种豆象个体微小（约2～5 mm），且寄主范围、生活习性和种间外部形态极为相似，给种类鉴定工作带来了极大的困难[1，9]。同时，豆象能够以卵、幼虫、蛹、成虫随寄主果实和运输工具等进行远距离人为传播，且主要以卵、幼虫、蛹等非成虫形态为主，需将其饲养至成虫才能进行种类鉴定，整个检疫鉴定过程长达数周，不适应口岸快速检验检疫的要求，且容易混淆误检，无法适应实际工作的需要。我国在进口货物上截获的豆象不单单存在于豆类上，在玉米、小麦、棉花等货物中也存在，极大地增加了检疫的难度[2]。因此，寻找一种正确快速的鉴定方法对口岸检验检疫具有十分重要的指导意义。
分子标记是实现分子鉴定的重要技术手段，目前已应用于昆虫近缘种、地理种群的鉴别。细胞色素C氧化酶含有13个亚基，其中细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）是细胞色素氧化酶的重要组成部分，编码该亚基的基因片段不同位置的进化速率有所不同，通过选取该基因的适宜基因片段进行测序和序列分析，进而在DNA水平上对物种进行正确地识别鉴定，已成为生物分类学研究的发展方向[1011]。相比于其他分子标记技术，由于其具有统一性和标准性而成为生物分类学研究中应用最为广泛的分子手段之一[1213]。目前，COⅠ基因已用于鳞翅目、膜翅目、半翅目等物种鉴定，并对基于形态学的物种分类进行了验证或修正[1415]。
本研究以在检疫中经常被截获的5种豆象为研究对象，设计了以COⅠ为目标基因的特异性引物并对其特异性进行验证，旨在建立豆象类害虫快速分子鉴定技术，为有效截阻豆象类害虫的传入及进一步扩散，保障我国豆类安全生产提供技术保障。 1材料与方法
1.1供试虫源
本研究所用的昆虫样品、来源和寄主见表1。所有虫源样品均用体式显微镜进行鉴定，以确定种类。用于分子生物学试验的豆象标本用100%乙醇浸泡并保存于-20℃冰箱。
1.2主要试剂
Taq DNA聚合酶、蛋白酶K、DL1000 DNA Marker、Tris、EDTA、SDS均购自TaKaRa公司。胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，其他生化试剂均为国产分析纯。
1.3基因组DNA的提取
豆象基因组DNA的提取参照Sunnuck等[16]的盐析法并稍作改进。将单头豆象于1.5 mL离心管中研磨粉碎，加入300 μL TENS （50 mmol/L Tris， pH 7.5， 400 mmol/L NaCl， 20 mmol/L EDTA， 0.5% SDS）和100 μg/mL蛋白酶K，于37℃水浴4 h，加入85 μL 5 mol/L NaCl剧烈振荡15 s；14 000 r/min离心5 min， 取上清液，加入等体积无水乙醇沉淀DNA，12 000 r/min离心5 min， 用70%乙醇洗涤沉淀2次，沉淀充分干燥后，加入30 μL蒸馏水溶解DNA，-20℃保存备用。
1.4特异引物对的设计
通过GenBank中登录的豌豆象（EF570097）、四纹豆象（AY625417）、蚕豆象（AY997313）、菜豆象（KF157281）和绿豆象（AY625416）的mtDNA CO Ⅰ序列，用DNAMAN软件对目标种的mtDNA COⅠ序列进行比对分析，根据分析结果，针对目的基因序列人工设计特异引物，并用Primer 5对引物进行评估，检查引物Tm值、GC%、错配、二聚体和发夹结构等，并用GenBank中的BLAST程序检查同源序列[17]。本研究共设计了30对引物，通过筛选获得能分别特异鉴定5种豆象的特异引物5对（表2），引物筛选的原则是所有引物在所设计的PCR反应体系和反应条件下能特异地鉴定出某一种豆象。引物由武汉擎科生物技术有限公司合成。
1.5PCR扩增
分别以单头豆象的基因组DNA为模板，用表2的特异性引物进行PCR扩增，以水作阴性对照。PCR反应体系（25 μL）：10×buffer（含Mg2 ）2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL、10 μmol/L引物（上、下游引物）各1.0 μL、2.5 U/μL Taq酶 0.2 μL、基因组DNA 1 μL，ddH2O 16.8 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、54℃退火30 s、72℃延伸1 min，35个循环；72℃ 10 min；4℃保存。取5 μL PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭（EB）染色，在凝胶成像系统中观察并成像分析。
1.6PCR产物回收测序
PCR产物采用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收纯化，回收纯化后的PCR产物由武汉擎科生物科技有限公司进行测序。
1.7特异引物对的灵敏度检测
供试豆象的基因组DNA用蒸馏水进行系列稀释，得到基因组DNA浓度分别为：50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL。分别取每种稀释液1 μL为模板（水为阴性对照），用上述5对特异性引物分别对5种豆象的基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳上检测。
2结果与分析
2.1引物特异性验证
用设计的特异性引物对所有供试豆象的基因组DNA进行PCR扩增，其中Bp1/Bp2仅在豌豆象基因组DNA扩增出166 bp特异性条带（图1）；Cm1/Cm2仅在四纹豆象基因组DNA中扩增出276 bp特异性条带（图2）；Br1/Br2仅在蚕豆象基因组DNA中扩增出167 bp特异性条带（图3）；Ao1/Ao2仅在菜豆象中扩增出432 bp特异性条带（图4）；Cc1/Cc2仅在绿豆象中扩增出274 bp特异性条带（图5），其他豆象基因组DNA及水对照均无扩增片段。表明设计的引物在供试豆象范围内具有特异性。
2.2PCR产物测序验证
分别对扩增出的PCR产物进行测序和序列分析，对产物的特异性进行进一步确认。经测序表明，豌豆象特异引物对扩增的PCR产物与原序列有5个碱基的差异，四纹豆象特异引物对扩增的PCR产物序列与原序列有4个碱基的差异，蚕豆象特异引物对扩增的PCR产物与原序列有9个碱基的差异，菜豆象特异引物对扩增的PCR产物与原序列有6个碱基的差异，绿豆象特异引物对扩增的PCR产物与原序列没有碱基的差异，造成这些差异的原因可能是测序的差异或者不同地理种群间序列存在差异。
2.3特异引物灵敏度检测
PCR方法的检测灵敏度分别用50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL等8种不同浓度的豆象DNA为模板来确定。由图2可知，当模板浓度为0.05 ng/μL时，豌豆象和四纹豆象特异引物对均没有扩增出特异性条带，当模板浓度为0.1 ng/μL及以上时，均产生特异性条带，而水对照即CK无扩增片段（图2）。由此可知，应用本试验的PCR鉴定方法可以检测到浓度为0.1 ng/μL的豌豆象和四纹豆象基因组DNA，灵敏度非常高。从图8～10可以看出，蚕豆象、菜豆象和绿豆象特异引物对的灵敏度为0.5 ng/μL。
3讨论
现代分子生物学技术尤其是分子标记技术为研究生物之间的进化关系开辟了新手段。PCR的广泛应用以及基因测序的精确和简便使分子系统分析达到空前的水平。许多研究者利用RFLP或RAPD标记分析物种或地理种群的遗传多态性，并据此推导其亲缘关系。如顾耕等[18]采用RAPD技术对生活在辣椒、番茄和烟草上的棉铃虫进行了寄主种群遗传分化的研究。魏晓棠等[19]利用AFLP技术对我国4个地理种群的棉褐带卷蛾进行遗传结构分析，为不同地理种群的棉褐带卷蛾的分类鉴定和遗传变异分析提供参考依据。但RFLP需要筛选大量的限制酶，而RAPD需要篩选大量随机引物。以核酸序列测定为基础，扩增单一的稳定条带，实现豆象的分子鉴定具有方便、稳定和可靠的优点。顾杰等[2021]结合PCR和酶切技术，从分子水平对鹰嘴豆象和四纹豆象进行了快速检测，鉴定灵敏度达10 ng/μL，并检测了四纹豆象4个地理种群的Cytb和COⅠ基因序列，对不同地理种群间遗传结构多态性进行了研究。本研究通过序列搜索比对，并对设计的相关引物进行筛选鉴定，获得5对能特异鉴定5种豆象的特异性引物，灵敏度达0.5 ng/μL以上，且该方法具有不受豆象发育阶段和环境条件的影响，对于非成虫态的样品及形态结构不完整的成虫样品，均能从基因序列上获得准确、可靠的鉴定信息等优点。该技术操作简便快捷，缩短了检测时间，提高了工作效率。因此，该技术可以用于豆象的检测鉴定工作，并在检疫性害虫的检疫检验与检测监测中具有重要应用价值。 参考文献
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[20]顾杰， 王莉萍， 毛雅琴， 等. 鹰嘴豆象与四纹豆象的分子检测技术[J]. 植物保护学报， 2010， 37（3）： 211216.
[21]顾杰， 毛雅琴， 王莉萍， 等. 四纹豆象不同地理种群的遗传分化[J]. 昆虫学报， 2009， 52（12）： 13491355.
（责任编辑：杨明丽）
本研究以在检疫中经常被截获的5种豆象为研究对象，通过对GenBank中5种豆象mtDNA COⅠ序列的查询，并进行序列比对，共设计了30对引物，通过筛选获得5对能分别鑒定5种豆象的特异引物，并用50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL 8个不同浓度系列的豆象DNA模板来检测灵敏度，结果表明，豌豆象和四纹豆象特异引物对的灵敏度为0.1 ng/μL，蚕豆象、菜豆象和绿豆象特异引物对的灵敏度为0.5 ng/μL。该方法可用于快速准确地鉴定5种豆象，对于豆象类害虫的检测监测具有重要意义。
关键词
豆象科；mtDNA COⅠ基因；特异引物；分子鉴定
中图分类号：
S 379
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.04.022
Abstract
Molecular identification of five bean weevils that were frequently intercepted from customs was studied in this paper. Based on the mtDNA COⅠ gene sequences of Callosobruchus chinensis， Bruchus rufimanus， B.pisorum， Acanthoscelides obtectus and C.maculatus from GenBank， 30 pairs of primers were designed， and the five bean weevils can be specifically identified by PCR amplification with five pairs of specific primers. Moreover， the sensitivity of PCR was detected at 50，25，10，5，1，0.5，0.1 and 0.05 ng/μL genomic DNA of C.chinensis， B.rufimanus， B.pisorum， A.obtectus and C.maculatus，respectively.The results showed that the sensitivity for B.pisorum and C.maculatus was 0.1 ng/μL， while 0.5 ng/μL for the other three. The method provides a rapid and reliable tool for identification of the five bean weevils， which could be applied in detecting and monitoring of bean weevil pests.
Key words
Bruchidae；mtDNA COⅠ gene；specific primers；molecular identification
豆象是豆象科昆虫的总称，分布于除南极之外的各大陆，尤其以亚洲的热带区以及中美和南美地区数量最多[1]。豆象科昆虫目前全世界记录约1 400种，分属于58个属[2]。该科昆虫大约有84%的种类取食豆科植物种子，成为栽培豆科植物的一类重要害虫[3]。1997年浙江宁海曾发生蚕豆象大规模为害，为害率高的达到80%以上，经济损失严重[4]。绿豆象严重为害绿豆、豇豆、鹰嘴豆、蚕豆和豌豆等多种豆类[56]，主要在仓内蛀食储藏的豆粒，造成的损失达30%以上[7]。我国共记载有18种储藏物中豆象科昆虫，其中绿豆象Callosobruchus chinensis、蚕豆象Bruchus rufimanus和豌豆象Bruchus pisorum为我国主要的储藏豆类害虫；而菜豆象Acanthoscelides obtectus和四纹豆象Callosobruchus maculatus为我国规定禁止入境的检疫性害虫[8]。
目前口岸检验检疫部门对豆象科昆虫的鉴定主要以成虫的外部形态特征作为鉴定依据，但本研究涉及的5种豆象个体微小（约2～5 mm），且寄主范围、生活习性和种间外部形态极为相似，给种类鉴定工作带来了极大的困难[1，9]。同时，豆象能够以卵、幼虫、蛹、成虫随寄主果实和运输工具等进行远距离人为传播，且主要以卵、幼虫、蛹等非成虫形态为主，需将其饲养至成虫才能进行种类鉴定，整个检疫鉴定过程长达数周，不适应口岸快速检验检疫的要求，且容易混淆误检，无法适应实际工作的需要。我国在进口货物上截获的豆象不单单存在于豆类上，在玉米、小麦、棉花等货物中也存在，极大地增加了检疫的难度[2]。因此，寻找一种正确快速的鉴定方法对口岸检验检疫具有十分重要的指导意义。
分子标记是实现分子鉴定的重要技术手段，目前已应用于昆虫近缘种、地理种群的鉴别。细胞色素C氧化酶含有13个亚基，其中细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）是细胞色素氧化酶的重要组成部分，编码该亚基的基因片段不同位置的进化速率有所不同，通过选取该基因的适宜基因片段进行测序和序列分析，进而在DNA水平上对物种进行正确地识别鉴定，已成为生物分类学研究的发展方向[1011]。相比于其他分子标记技术，由于其具有统一性和标准性而成为生物分类学研究中应用最为广泛的分子手段之一[1213]。目前，COⅠ基因已用于鳞翅目、膜翅目、半翅目等物种鉴定，并对基于形态学的物种分类进行了验证或修正[1415]。
本研究以在检疫中经常被截获的5种豆象为研究对象，设计了以COⅠ为目标基因的特异性引物并对其特异性进行验证，旨在建立豆象类害虫快速分子鉴定技术，为有效截阻豆象类害虫的传入及进一步扩散，保障我国豆类安全生产提供技术保障。 1材料与方法
1.1供试虫源
本研究所用的昆虫样品、来源和寄主见表1。所有虫源样品均用体式显微镜进行鉴定，以确定种类。用于分子生物学试验的豆象标本用100%乙醇浸泡并保存于-20℃冰箱。
1.2主要试剂
Taq DNA聚合酶、蛋白酶K、DL1000 DNA Marker、Tris、EDTA、SDS均购自TaKaRa公司。胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，其他生化试剂均为国产分析纯。
1.3基因组DNA的提取
豆象基因组DNA的提取参照Sunnuck等[16]的盐析法并稍作改进。将单头豆象于1.5 mL离心管中研磨粉碎，加入300 μL TENS （50 mmol/L Tris， pH 7.5， 400 mmol/L NaCl， 20 mmol/L EDTA， 0.5% SDS）和100 μg/mL蛋白酶K，于37℃水浴4 h，加入85 μL 5 mol/L NaCl剧烈振荡15 s；14 000 r/min离心5 min， 取上清液，加入等体积无水乙醇沉淀DNA，12 000 r/min离心5 min， 用70%乙醇洗涤沉淀2次，沉淀充分干燥后，加入30 μL蒸馏水溶解DNA，-20℃保存备用。
1.4特异引物对的设计
通过GenBank中登录的豌豆象（EF570097）、四纹豆象（AY625417）、蚕豆象（AY997313）、菜豆象（KF157281）和绿豆象（AY625416）的mtDNA CO Ⅰ序列，用DNAMAN软件对目标种的mtDNA COⅠ序列进行比对分析，根据分析结果，针对目的基因序列人工设计特异引物，并用Primer 5对引物进行评估，检查引物Tm值、GC%、错配、二聚体和发夹结构等，并用GenBank中的BLAST程序检查同源序列[17]。本研究共设计了30对引物，通过筛选获得能分别特异鉴定5种豆象的特异引物5对（表2），引物筛选的原则是所有引物在所设计的PCR反应体系和反应条件下能特异地鉴定出某一种豆象。引物由武汉擎科生物技术有限公司合成。
1.5PCR扩增
分别以单头豆象的基因组DNA为模板，用表2的特异性引物进行PCR扩增，以水作阴性对照。PCR反应体系（25 μL）：10×buffer（含Mg2 ）2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL、10 μmol/L引物（上、下游引物）各1.0 μL、2.5 U/μL Taq酶 0.2 μL、基因组DNA 1 μL，ddH2O 16.8 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、54℃退火30 s、72℃延伸1 min，35个循环；72℃ 10 min；4℃保存。取5 μL PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭（EB）染色，在凝胶成像系统中观察并成像分析。
1.6PCR产物回收测序
PCR产物采用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收纯化，回收纯化后的PCR产物由武汉擎科生物科技有限公司进行测序。
1.7特异引物对的灵敏度检测
供试豆象的基因组DNA用蒸馏水进行系列稀释，得到基因组DNA浓度分别为：50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL。分别取每种稀释液1 μL为模板（水为阴性对照），用上述5对特异性引物分别对5种豆象的基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳上检测。
2结果与分析
2.1引物特异性验证
用设计的特异性引物对所有供试豆象的基因组DNA进行PCR扩增，其中Bp1/Bp2仅在豌豆象基因组DNA扩增出166 bp特异性条带（图1）；Cm1/Cm2仅在四纹豆象基因组DNA中扩增出276 bp特异性条带（图2）；Br1/Br2仅在蚕豆象基因组DNA中扩增出167 bp特异性条带（图3）；Ao1/Ao2仅在菜豆象中扩增出432 bp特异性条带（图4）；Cc1/Cc2仅在绿豆象中扩增出274 bp特异性条带（图5），其他豆象基因组DNA及水对照均无扩增片段。表明设计的引物在供试豆象范围内具有特异性。
2.2PCR产物测序验证
分别对扩增出的PCR产物进行测序和序列分析，对产物的特异性进行进一步确认。经测序表明，豌豆象特异引物对扩增的PCR产物与原序列有5个碱基的差异，四纹豆象特异引物对扩增的PCR产物序列与原序列有4个碱基的差异，蚕豆象特异引物对扩增的PCR产物与原序列有9个碱基的差异，菜豆象特异引物对扩增的PCR产物与原序列有6个碱基的差异，绿豆象特异引物对扩增的PCR产物与原序列没有碱基的差异，造成这些差异的原因可能是测序的差异或者不同地理种群间序列存在差异。
2.3特异引物灵敏度检测
PCR方法的检测灵敏度分别用50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL等8种不同浓度的豆象DNA为模板来确定。由图2可知，当模板浓度为0.05 ng/μL时，豌豆象和四纹豆象特异引物对均没有扩增出特异性条带，当模板浓度为0.1 ng/μL及以上时，均产生特异性条带，而水对照即CK无扩增片段（图2）。由此可知，应用本试验的PCR鉴定方法可以检测到浓度为0.1 ng/μL的豌豆象和四纹豆象基因组DNA，灵敏度非常高。从图8～10可以看出，蚕豆象、菜豆象和绿豆象特异引物对的灵敏度为0.5 ng/μL。
3讨论
现代分子生物学技术尤其是分子标记技术为研究生物之间的进化关系开辟了新手段。PCR的广泛应用以及基因测序的精确和简便使分子系统分析达到空前的水平。许多研究者利用RFLP或RAPD标记分析物种或地理种群的遗传多态性，并据此推导其亲缘关系。如顾耕等[18]采用RAPD技术对生活在辣椒、番茄和烟草上的棉铃虫进行了寄主种群遗传分化的研究。魏晓棠等[19]利用AFLP技术对我国4个地理种群的棉褐带卷蛾进行遗传结构分析，为不同地理种群的棉褐带卷蛾的分类鉴定和遗传变异分析提供参考依据。但RFLP需要筛选大量的限制酶，而RAPD需要篩选大量随机引物。以核酸序列测定为基础，扩增单一的稳定条带，实现豆象的分子鉴定具有方便、稳定和可靠的优点。顾杰等[2021]结合PCR和酶切技术，从分子水平对鹰嘴豆象和四纹豆象进行了快速检测，鉴定灵敏度达10 ng/μL，并检测了四纹豆象4个地理种群的Cytb和COⅠ基因序列，对不同地理种群间遗传结构多态性进行了研究。本研究通过序列搜索比对，并对设计的相关引物进行筛选鉴定，获得5对能特异鉴定5种豆象的特异性引物，灵敏度达0.5 ng/μL以上，且该方法具有不受豆象发育阶段和环境条件的影响，对于非成虫态的样品及形态结构不完整的成虫样品，均能从基因序列上获得准确、可靠的鉴定信息等优点。该技术操作简便快捷，缩短了检测时间，提高了工作效率。因此，该技术可以用于豆象的检测鉴定工作，并在检疫性害虫的检疫检验与检测监测中具有重要应用价值。 参考文献
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（责任编辑：杨明丽）