探讨下调甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。
方法(1)实验分为3组：下调MTRR基因表达的SKOV3/DDP细胞(SKOV3/DDP-MTRRi组)、转染阴性对照(NC)序列的SKOV3/DDP细胞(SKOV3/DDP-NC组，作为阴性对照)、未转染的SKOV3/DDP细胞(SKOV3/DDP组，作为空白对照)。不同浓度(0、1、2、4 μg/ml)顺铂作用后，采用流式细胞仪检测3组细胞的凋亡率，免疫荧光法检测3组细胞的自噬现象，蛋白印迹(western blot)法检测3组细胞中自噬标志分子自噬微管相关蛋白轻链3β(LC3B)、p62蛋白的表达，透射电镜观察3组细胞中自噬体的形成情况。(2)雷帕霉素诱导后SKOV3/DDP-MTRRi细胞自噬及凋亡情况变化的检测，实验分为4组，雷帕霉素组(5 nmol/L雷帕霉素处理)、雷帕霉素+顺铂组(5 nmol/L雷帕霉素+4 μg/ml顺铂处理)、顺铂组(4 μg/ml顺铂处理)、空白对照组，采用western blot法检测4组细胞中自噬标志分子LC3B、p62蛋白的表达，四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测4组细胞的生存率，流式细胞仪检测4组细胞的凋亡率。(3)4 μg/ml顺铂作用48 h后，western blot法检测3组(即SKOV3/DDP-MTRRi组、SKOV3/DDP-NC组、SKOV3/DDP组)细胞中凋亡相关因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)和Bcl-2家族以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)自噬通路关键蛋白的表达。
结果(1)不同浓度(0、1、2、4 μg/ml)顺铂作用48 h后，随着顺铂浓度的增加，3组细胞的凋亡逐渐增加，当顺铂浓度达到2 μg/ml时，SKOV3/DDP-MTRRi组细胞的凋亡率[(26.2± 1.4)%]明显高于SKOV3/DDP-NC组和SKOV3/DDP组［分别为(14.8±2.4)%、(14.2±2.4)%；P<0.05]；免疫荧光法检测显示，随着顺铂浓度增加，SKOV3/DDP-MTRRi组细胞中LC3B蛋白在细胞质内聚集成团，明显多于SKOV3/DDP组和SKOV3/DDP-NC组；且与SKOV3/DDP组和SKOV3/DDP-NC组比较，SKOV3/DDP-MTRRi组细胞中LC3B蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，p62蛋白表达水平明显升高(P< 0.05)；当顺铂浓度达到4 μg/ml时，SKOV3/DDP组和SKOV3/DDP-NC组细胞内的细胞器结构完整，有少量自噬线粒体出现；而SKOV3/DDP-MTRRi组细胞内的细胞器结构消失，空泡明显增多，且没有观察到自噬体的形成。(2)与雷帕霉素组、顺铂组及空白对照组相比，雷帕霉素+顺铂组SKOV3/DDP-MTRRi细胞中LC3B蛋白的表达水平(分别为1.43±0.04、1.37±0.11、1.11±0.09、1.72±0.08)明显升高(P<0.05)，p62蛋白的表达水平(分别为0.94±0.12、1.21±0.11、1.57±0.10、0.58±0.10)明显降低(P< 0.05)；与顺铂组比较，雷帕霉素＋顺铂组SKOV3/DDP-MTRRi细胞的生存率［分别为(0.62±0.03)%、(0.78±0.03)%]明显升高(P=0.018)，凋亡率［分别为(59.0±3.9)%、(40.4±3.0)%]明显降低(P=0.019)。(3)4 μg/ml顺铂处理48 h后，与SKOV3/DDP-NC组、SKOV3/DDP组比较，SKOV3/DDP-MTRRi组细胞中Bcl-2家族成员Bax蛋白的表达水平无明显变化(P=0.661)，而Bcl-2蛋白的表达水平明显降低(P= 0.030)；caspase家族成员caspase-3、caspase-7、caspase-9、多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶(PARP)蛋白的表达水平无明显变化(P>0.05)，而裂解的caspase-3、caspase-7、caspase-9、PARP蛋白的表达水平均明显升高(P<0.05)。SKOV3/DDP-MTRRi组细胞中PI3K/Akt自噬通路关键蛋白细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)，而第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)蛋白的表达水平显著下降(P<0.05)。
结论顺铂诱导可使MTRR基因下调的顺铂耐药卵巢癌细胞的凋亡增加、自噬减弱，其可能机制为通过调节caspase和Bcl-2凋亡家族蛋白以及PI3K/Akt自噬通路中关键蛋白的表达，从而增加细胞对顺铂的敏感性。