【摘 要】
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目的 对链霉亲和素(SA)进行定点突变,降低与生物素之间的亲和力,制备SA突变体琼脂糖凝胶柱,并摸索最适洗脱条件,以达到纯化生物素修饰蛋白的目的.方法 原核表达SA突变体蛋白
【机 构】
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新乡医学院医学检验学院,河南新乡 453003空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,陕西西安710032;新乡医学院医学检验学院,河南新乡 453003;空军军医大学基础医学院免疫学教研室
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目的 对链霉亲和素(SA)进行定点突变,降低与生物素之间的亲和力,制备SA突变体琼脂糖凝胶柱,并摸索最适洗脱条件,以达到纯化生物素修饰蛋白的目的.方法 原核表达SA突变体蛋白使用Ni-NTA纯化树脂进行纯化,将SA突变体蛋白与溴化氰活化琼脂糖凝胶4FF(CNBr-activated Bestarose TM 4FF)偶联制备凝胶柱.生物素修饰蛋白与凝胶柱孵育后,以不同浓度NaOH对生物素修饰蛋白进行洗脱回收,ELISA检测SA突变体蛋白亲和力.通过Western blot法、考马斯亮蓝染色检测纯化效果.结果 成功表达并纯化五种SA突变体,并制备凝胶柱.ELISA结果计算得到SA突变体对生物素修饰蛋白的亲和常数相较野生型SA均有所降低.将生物素修饰蛋白与五种凝胶柱相结合,通过Western blot法和考马斯亮蓝染色结果筛选出SA突变体M2凝胶柱可以在10 mmol/L NaOH洗脱条件下,纯化出生物素修饰蛋白,并且SA突变体M2凝胶柱能够对生物素修饰蛋白进行再次纯化.结论 成功制备了SA突变体琼脂糖凝胶柱,为生物素修饰蛋白的纯化提供了可行性方案.
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