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摘要：目的： 研究HPV16E6与E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达。方法 ：采用免疫组化、蛋白免疫印迹法分别检测宫颈鳞癌、正常宫颈组织中HPV16E6与E-钙黏蛋白的表达并分析两者的关系。结果： 免疫组化结果显示HPV16E6蛋白在正常宫颈组织、宫颈鳞癌中的阳性表达率分别为13.33%、76.67%，差异有统计学意义（x2=32.490，p=0.000）。E-钙黏蛋白在正常宫颈组织、宫颈鳞癌中的阳性表达率分别为100%、56.67%，差异有统计学意义（x2= 18.281，p=0.000）。蛋白免疫印迹法结果显示HPV16E6蛋白在宫颈鳞癌组织、正常宫颈组织中的表达差异有统计学意义（F =284.962，p = 0.000）。E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌组织、正常宫颈组织中的表达差异有统计学意义（F =121.220，p = 0.000）。分析HPV16E6与E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌组中的表达，提示两者表达呈负相关（rp = -0.647 ，p= 0.000）.结论：HPV16E6在宫颈鳞癌中表达增加，E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌中的表达减少，两者表达呈负相关，提示HPV16E6与E-钙黏蛋白间可能存在某种作用机制，共同参与宫颈癌的发生发展，有待更加深入的研究。
关键词：HPV16E6蛋白 E-钙黏蛋白 宫颈鳞癌
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，病理类型中以宫颈鳞癌多见。持续性高危型人乳头瘤（HPV）病毒感染是导致宫颈癌发生发展必不可少的因素，约50-70%宫颈癌患者存在HPV16型病毒的感染[1]。仅有一小部分患者感染HPV病毒后最终演变为宫颈癌，表明在宫颈癌的进展过程中存在其它因素的参与[2]。E-钙黏蛋白是介导细胞与细胞黏附的重要分子，在维持组织结构的稳定性中起着关键的作用。E-钙黏蛋白表达异常是恶性肿瘤的重要标志，与细胞的浸润转移及多种肿瘤的不良预后密切相关[3]。
本研究采用免疫组织化学（免疫组化）法、蛋白质免疫印迹法检测宫颈鳞癌组织中HPV16E6和E-钙黏蛋白的表达，分析两者在宫颈鳞癌中的表达相关性，以期为宫颈癌的早期诊断及预后评估提供参考。
一、材料与方法
1临床资料
选取2012年1月- 2014年8月间湖南省肿瘤医院收治的病理证实为宫颈鳞癌行手术切除或宫颈活检的100例宫颈组织为研究对象，年龄 29 - 63岁，平均年龄（ 48.94± 7.63）岁，选用同期因子宫肌瘤行子宫全切术且宫颈正常的42例宫颈组织作为对照组。免疫组化标本经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片;蛋白免疫印迹法采用的标本在离体后1小时内用冰的生理盐水溶液冲洗干净后置于-80℃冰箱中保存备用。所有病例均为初治病例，术前未予任何抗肿瘤治疗，临床资料完整，所有病理标本均经至少两位病理医生诊断证实。
2实验方法
2.1免疫组化学
2.1.1免疫组化步骤
采用免疫组织化学SP二步法，试剂盒购自康为世纪有限公司，具体步骤按试剂盒说明书所示进行：将石蜡切片用二甲苯脱蜡2次（每次10分钟），不同浓度梯度乙醇脱水，用3%过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶，PH6.0柠檬酸盐微波抗原修复8分钟，自然冷却后PBS液洗涤。分别加入HPV16E6一抗（稀释比1：50 ）、E-钙黏蛋白 一抗 （，稀释比1：100），湿盒室温孵育2小时，PBS液洗涤。分别加相应二抗， 室温孵育30分钟，蒸馏水冲洗。加入DAB显色液，显微镜下观察适时显色终止，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。显微镜下观察拍照。用已知阳性切片作为阳性对照。PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。
2.1.2 免疫组织化学结果判定
光学显微镜下进行双盲法阅片：HPV 16 E6蛋白为细胞核染色，以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性染色。E-钙黏蛋白的正常阳性表达为细胞膜上出现棕黄色颗粒。每例标本在光学显微镜下随机选取10个高倍视野（×400），分别计数每个视野内阳性细胞数，取平均值计算阳性细胞百分率。据染色强度及阳性细胞数百分比综合判定，观察每个视野内阳性细胞的染色深浅程度评分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;阳性细胞所占百分比评分：小于10%为0分，10-30%为1分，30-60%为2分，大于60%为3分。最后将两数值相乘来判定蛋白表达的阳性等级：0分为阴性（-），1-2分弱阳性（+），大于2分为强阳性（++）。
2.2 蛋白质免疫印迹法
取适量宫颈组织于研钵中，加入组织裂解液中冰上手工充分匀浆，4℃ 12000rpm离心10min，取上清液即为组织蛋白，取5ul样本用BCA蛋白浓度定量试剂盒测定总蛋白浓度。向剩余各样本中加入等体积2×上样缓冲液，100℃变性6分钟。各组取约20ug组织总蛋白经 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，产物转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭过夜。TBST洗涤3次，每次6分钟，以标准蛋白分子量作为参照标准，取18kb处条带加入HPV16E6一抗（稀释比1：500 ）、 120kb处条带加入E-钙黏蛋白 一抗（稀释比1：2000 ）摇床反应2小时，TBST洗涤后分别加入生物素标记的二抗摇床反应40分钟，洗膜后与ECL发光液结合，显影，以Actin蛋白为内参对照。用AlphaEase FC软件计算各条带灰度值，蛋白相对表达量=相蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。
二、统计学处理
采用SPSS18.0统计软件对实验数据进行统计学分析，计数资料采用x2检验，不满足x2检验条件者采用Fisher确切概率法。Western blot数据采用_（_采）±s表示，差异显著性检验采用方差齐性检验，LSD法进行组间比较，相关性采用Pearson相关分析。以p <0.05为差异有统计学意义。 三、结果
1 免疫组化结果
HPV16E6在宫颈鳞癌组中阳性表达率为76.67%（46/60），正常宫颈组中阳性表达率为13.33 %（4/30），两者比较差异有统计学意义（x2=32.490，p=0.000）; E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌组中阳性表达率为56.67%（34/60），正常宫颈组织中阳性表达率为100%（30/30），差异有统计学意义（x2= 18.281，p=0.000）。
2 蛋白免疫印迹法结果
2.1 HPV16E6与E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌组织、正常宫颈组织中的表达
比较HPV16E6蛋白在宫颈鳞癌、正常宫颈组织中的表达（0.394±0.061 vs 0.394±0.061），差异有统计学意义（F =284.962，p = 0.000）。E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达较正常宫颈组织中表达减少（0.566±0.186 vs 1.170±0.592），两者比较差异有统计学意义（F =121.220，p =0.000）。
2.2 HPV16E6与E-钙黏蛋白表达的相关性
分析宫颈鳞癌中E-钙黏蛋白与HPV16E6蛋白的表达，两者呈负相关（rp = -0.647 ，p= 0.000）。
四、讨论
HPV16的致癌性主要是通过E6、E7原癌蛋白发挥作用。本研究中免疫组化显示，HPV16E6蛋白在正常对照组、宫颈鳞癌组中阳性表达率分别为13.33%、76.67%，两者比较差异有显著性（p=0.000）。Western blot结果显示HPV16E6蛋白在宫颈鳞癌组织中表达增加，与正常宫颈组织比较，差异有统计学意义（p = 0.000）。证明HPV16病毒与宫颈癌发生发展关系密切，HPV16E6原癌蛋白参与宫颈癌的致癌作用。
HPV病毒感染是宫颈癌发生发展的必要因素，但不是唯一因素。在上皮性肿瘤发生过程中，细胞通常会失去原有特性，获得间质表型，即为上皮间质转化。E-钙黏蛋白表达下调在上皮间质转化过程中发挥着重要的作用，与肿瘤的侵袭转移和不良预后有明显的相关性 [4]。
本研究显示， E-钙黏蛋白在正常对照组、宫颈鳞癌组中的表达阳性率分别为100%、56.67%，随宫颈病变加重，阳性表达率下降，差异有显著性（p=0.000），表明E-钙黏蛋白表达下调可导致宫颈癌细胞黏附性下降，促进浸润转移。比较E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌组织、正常宫颈组织中的相对表达量，差异有显著性（0.566±0.186 vs 1.170±0.592，p = 0.000），表明E-钙黏蛋白参与宫颈癌的发生发展。Tang等[5]研究显示，E-钙黏蛋白的表达与总生存率、复发之间的关系显示， E-钙黏蛋白阴性的患者较阳性患者无瘤间期更短、总生存率差、复发率及转移率高。
Matthews 等[3]研究显示HPV16病毒感染后，E6原癌蛋白会干扰角化细胞表达E-钙黏蛋白，导致其表达下调。有体外研究显示，HPV16E6通过抑制鳞状细胞癌细胞中的E-钙黏蛋白的表达，从而促进肿瘤的侵袭和转移。因此推测HPV16E6可能通过抑制E-钙黏蛋白的表达促进肿瘤的侵袭和转移。Cheng等[6]研究显示，E-钙黏蛋白在HPV16E6/E7转染后的宫颈癌细胞系中的表达较未转染者中的表达下调，HPV16E6/E7转染宫颈上皮细胞后可诱导上皮间质转化，抑制E-钙黏蛋白的表达。
本研究通过分析比较HPV16E6与E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌中的表达显示两者呈负相关（rp = -0.647 ，p= 0.000），预示两者可能存在某种潜在的相互作用。但是目前为止两者之间具体的作用机制究竟为何尚不明确，期待关于HPV16E6与E-钙黏蛋白更为深入研究使宫颈癌发病机制更加明确，以期为宫颈癌的早诊早治提供有价值的分子标记物。
参考文献：
[1] Zur Hausen H. Papillomaviruses in the causation of human cancers - a brief historical account. Virology 2009，384：260-65.
[2]Mühlen S， Behren A， Iftner T et al.Influence of HPV16E2 and its localisation on the expression of matrix metalloproteinase-9. Int J Oncol2010， 37： 337-45.
[3] Matthews K， et al .？Depletion of Langerhans cells in human papillomavirus type 16-infected skin is associated with E6-mediated down regulation of E-钙黏蛋白.？J. Virol. 2003，77：8378-85.
[4] Gallo D， Ferlini C， ScambiaG. The epithelial-mesenchymal transition and the estrogen-signaling in ovarian cancer. Curr Drug Targets 2010， 11： 474-81.
[5]Tang D， Xu S， Zhang Q，et al. The expression and clinical significance of the androgen receptor and E-钙黏蛋白 in triple-negative breast cancer. Med Oncol 2012， 29： 526-33.
[6] Cheng YM ， Chou CY，HSU YC et al. The role of human papillomavirus type 16 E6/E7 oncoproteins in cervical epithelial-mesenchymal transition and carcinogenesis. ONCOLOGY LETTERS2012， 3： 667-71.
关键词：HPV16E6蛋白 E-钙黏蛋白 宫颈鳞癌
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，病理类型中以宫颈鳞癌多见。持续性高危型人乳头瘤（HPV）病毒感染是导致宫颈癌发生发展必不可少的因素，约50-70%宫颈癌患者存在HPV16型病毒的感染[1]。仅有一小部分患者感染HPV病毒后最终演变为宫颈癌，表明在宫颈癌的进展过程中存在其它因素的参与[2]。E-钙黏蛋白是介导细胞与细胞黏附的重要分子，在维持组织结构的稳定性中起着关键的作用。E-钙黏蛋白表达异常是恶性肿瘤的重要标志，与细胞的浸润转移及多种肿瘤的不良预后密切相关[3]。
本研究采用免疫组织化学（免疫组化）法、蛋白质免疫印迹法检测宫颈鳞癌组织中HPV16E6和E-钙黏蛋白的表达，分析两者在宫颈鳞癌中的表达相关性，以期为宫颈癌的早期诊断及预后评估提供参考。
一、材料与方法
1临床资料
选取2012年1月- 2014年8月间湖南省肿瘤医院收治的病理证实为宫颈鳞癌行手术切除或宫颈活检的100例宫颈组织为研究对象，年龄 29 - 63岁，平均年龄（ 48.94± 7.63）岁，选用同期因子宫肌瘤行子宫全切术且宫颈正常的42例宫颈组织作为对照组。免疫组化标本经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片;蛋白免疫印迹法采用的标本在离体后1小时内用冰的生理盐水溶液冲洗干净后置于-80℃冰箱中保存备用。所有病例均为初治病例，术前未予任何抗肿瘤治疗，临床资料完整，所有病理标本均经至少两位病理医生诊断证实。
2实验方法
2.1免疫组化学
2.1.1免疫组化步骤
采用免疫组织化学SP二步法，试剂盒购自康为世纪有限公司，具体步骤按试剂盒说明书所示进行：将石蜡切片用二甲苯脱蜡2次（每次10分钟），不同浓度梯度乙醇脱水，用3%过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶，PH6.0柠檬酸盐微波抗原修复8分钟，自然冷却后PBS液洗涤。分别加入HPV16E6一抗（稀释比1：50 ）、E-钙黏蛋白 一抗 （，稀释比1：100），湿盒室温孵育2小时，PBS液洗涤。分别加相应二抗， 室温孵育30分钟，蒸馏水冲洗。加入DAB显色液，显微镜下观察适时显色终止，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。显微镜下观察拍照。用已知阳性切片作为阳性对照。PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。
2.1.2 免疫组织化学结果判定
光学显微镜下进行双盲法阅片：HPV 16 E6蛋白为细胞核染色，以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性染色。E-钙黏蛋白的正常阳性表达为细胞膜上出现棕黄色颗粒。每例标本在光学显微镜下随机选取10个高倍视野（×400），分别计数每个视野内阳性细胞数，取平均值计算阳性细胞百分率。据染色强度及阳性细胞数百分比综合判定，观察每个视野内阳性细胞的染色深浅程度评分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;阳性细胞所占百分比评分：小于10%为0分，10-30%为1分，30-60%为2分，大于60%为3分。最后将两数值相乘来判定蛋白表达的阳性等级：0分为阴性（-），1-2分弱阳性（+），大于2分为强阳性（++）。
2.2 蛋白质免疫印迹法
取适量宫颈组织于研钵中，加入组织裂解液中冰上手工充分匀浆，4℃ 12000rpm离心10min，取上清液即为组织蛋白，取5ul样本用BCA蛋白浓度定量试剂盒测定总蛋白浓度。向剩余各样本中加入等体积2×上样缓冲液，100℃变性6分钟。各组取约20ug组织总蛋白经 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，产物转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭过夜。TBST洗涤3次，每次6分钟，以标准蛋白分子量作为参照标准，取18kb处条带加入HPV16E6一抗（稀释比1：500 ）、 120kb处条带加入E-钙黏蛋白 一抗（稀释比1：2000 ）摇床反应2小时，TBST洗涤后分别加入生物素标记的二抗摇床反应40分钟，洗膜后与ECL发光液结合，显影，以Actin蛋白为内参对照。用AlphaEase FC软件计算各条带灰度值，蛋白相对表达量=相蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。
二、统计学处理
采用SPSS18.0统计软件对实验数据进行统计学分析，计数资料采用x2检验，不满足x2检验条件者采用Fisher确切概率法。Western blot数据采用_（_采）±s表示，差异显著性检验采用方差齐性检验，LSD法进行组间比较，相关性采用Pearson相关分析。以p <0.05为差异有统计学意义。 三、结果
1 免疫组化结果
HPV16E6在宫颈鳞癌组中阳性表达率为76.67%（46/60），正常宫颈组中阳性表达率为13.33 %（4/30），两者比较差异有统计学意义（x2=32.490，p=0.000）; E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌组中阳性表达率为56.67%（34/60），正常宫颈组织中阳性表达率为100%（30/30），差异有统计学意义（x2= 18.281，p=0.000）。
2 蛋白免疫印迹法结果
2.1 HPV16E6与E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌组织、正常宫颈组织中的表达
比较HPV16E6蛋白在宫颈鳞癌、正常宫颈组织中的表达（0.394±0.061 vs 0.394±0.061），差异有统计学意义（F =284.962，p = 0.000）。E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达较正常宫颈组织中表达减少（0.566±0.186 vs 1.170±0.592），两者比较差异有统计学意义（F =121.220，p =0.000）。
2.2 HPV16E6与E-钙黏蛋白表达的相关性
分析宫颈鳞癌中E-钙黏蛋白与HPV16E6蛋白的表达，两者呈负相关（rp = -0.647 ，p= 0.000）。
四、讨论
HPV16的致癌性主要是通过E6、E7原癌蛋白发挥作用。本研究中免疫组化显示，HPV16E6蛋白在正常对照组、宫颈鳞癌组中阳性表达率分别为13.33%、76.67%，两者比较差异有显著性（p=0.000）。Western blot结果显示HPV16E6蛋白在宫颈鳞癌组织中表达增加，与正常宫颈组织比较，差异有统计学意义（p = 0.000）。证明HPV16病毒与宫颈癌发生发展关系密切，HPV16E6原癌蛋白参与宫颈癌的致癌作用。
HPV病毒感染是宫颈癌发生发展的必要因素，但不是唯一因素。在上皮性肿瘤发生过程中，细胞通常会失去原有特性，获得间质表型，即为上皮间质转化。E-钙黏蛋白表达下调在上皮间质转化过程中发挥着重要的作用，与肿瘤的侵袭转移和不良预后有明显的相关性 [4]。
本研究显示， E-钙黏蛋白在正常对照组、宫颈鳞癌组中的表达阳性率分别为100%、56.67%，随宫颈病变加重，阳性表达率下降，差异有显著性（p=0.000），表明E-钙黏蛋白表达下调可导致宫颈癌细胞黏附性下降，促进浸润转移。比较E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌组织、正常宫颈组织中的相对表达量，差异有显著性（0.566±0.186 vs 1.170±0.592，p = 0.000），表明E-钙黏蛋白参与宫颈癌的发生发展。Tang等[5]研究显示，E-钙黏蛋白的表达与总生存率、复发之间的关系显示， E-钙黏蛋白阴性的患者较阳性患者无瘤间期更短、总生存率差、复发率及转移率高。
Matthews 等[3]研究显示HPV16病毒感染后，E6原癌蛋白会干扰角化细胞表达E-钙黏蛋白，导致其表达下调。有体外研究显示，HPV16E6通过抑制鳞状细胞癌细胞中的E-钙黏蛋白的表达，从而促进肿瘤的侵袭和转移。因此推测HPV16E6可能通过抑制E-钙黏蛋白的表达促进肿瘤的侵袭和转移。Cheng等[6]研究显示，E-钙黏蛋白在HPV16E6/E7转染后的宫颈癌细胞系中的表达较未转染者中的表达下调，HPV16E6/E7转染宫颈上皮细胞后可诱导上皮间质转化，抑制E-钙黏蛋白的表达。
本研究通过分析比较HPV16E6与E-钙黏蛋白在宫颈鳞癌中的表达显示两者呈负相关（rp = -0.647 ，p= 0.000），预示两者可能存在某种潜在的相互作用。但是目前为止两者之间具体的作用机制究竟为何尚不明确，期待关于HPV16E6与E-钙黏蛋白更为深入研究使宫颈癌发病机制更加明确，以期为宫颈癌的早诊早治提供有价值的分子标记物。
参考文献：
[1] Zur Hausen H. Papillomaviruses in the causation of human cancers - a brief historical account. Virology 2009，384：260-65.
[2]Mühlen S， Behren A， Iftner T et al.Influence of HPV16E2 and its localisation on the expression of matrix metalloproteinase-9. Int J Oncol2010， 37： 337-45.
[3] Matthews K， et al .？Depletion of Langerhans cells in human papillomavirus type 16-infected skin is associated with E6-mediated down regulation of E-钙黏蛋白.？J. Virol. 2003，77：8378-85.
[4] Gallo D， Ferlini C， ScambiaG. The epithelial-mesenchymal transition and the estrogen-signaling in ovarian cancer. Curr Drug Targets 2010， 11： 474-81.
[5]Tang D， Xu S， Zhang Q，et al. The expression and clinical significance of the androgen receptor and E-钙黏蛋白 in triple-negative breast cancer. Med Oncol 2012， 29： 526-33.
[6] Cheng YM ， Chou CY，HSU YC et al. The role of human papillomavirus type 16 E6/E7 oncoproteins in cervical epithelial-mesenchymal transition and carcinogenesis. ONCOLOGY LETTERS2012， 3： 667-71.