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【摘要】 目的：观察烟草烟雾暴露人气道上皮细胞（16HBE）后，发生间充质转分化（EMT）样改变。方法：（1）以不同浓度（5～50 μg/mL）CSC刺激16HBE 7 d，用CCKit-8检测细胞总体活性，筛选最佳浓度。（2）用CSC最大活性影响浓度刺激16HBE 7 d，观察细胞形态改变，经Western-blot法和细胞免疫荧光技术检测上皮细胞标志物E钙黏蛋白（E-cad）及EMT标记物1型胶原（COL1）、波形蛋白（Vimentin）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达水平。结果：（1）不同浓度CSC刺激后，16HBE在
10 μg/mL时OD值最高，为（2.562±0.045）。各浓度间OD值比较差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）经10 μg/mL CSC刺激后，部分16HBE形态由鹅卵石状向长梭形、多角形或星形改变。（3）Western-blot检测发现试验组COL1、MMP-9的蛋白表达量分别为（0.566±0.011）和（0.463±0.003），高于对照组（0.272±0.020）和（0.201±0.023），差异均有统计学意义（P<0.05）；而E-cad蛋白表达量则明显低于对照组，分别为（0.301±0.041）和（0.591±0.068），差异有统计学意义（P<0.05）。（4）细胞免疫荧光检测发现试验组COL1、Vimentin和MMP-9蛋白表达量均高于对照组（P<0.05）；而E-cad蛋白表达量明显低于对照组（P<0.05）。结论：经CSC刺激后，16HBE可出现转分化样改变。
【关键词】 烟草烟雾凝集物； 气道上皮细胞； 上皮细胞间充质转分化
【Abstract】 Objective：To observe the epithelial-mesenchymal transition in human bronchial epithelial cells（16HBE） exposed to cigarette smoke.Method：Cells were stimulated by cigarrette smoke condensate（CSC） with different concentrations（5-50 μg/mL） for 7 days，then chosen the optimal concentration by cell counting kit-8.Western blot and Immunofluorescence method were used to estimate the expression levels of E-cad，type 1 collagen，Vimentin and MMP-9 in 16HBE induced with CSC （10 μg/mL） for 7 days.Result：16HBE manifested a morphological characteristic of loss of cell-cell contact and elongated shape，after 7 days induced with CSC.The level of E-cad downregulated in the experimental group[Western blot（0.301±0.041） vs （0.591±0.068），P<0.05].In contrast，upregulations in expression of type 1 collagen[Western blot （0.566±0.011） vs （0.272±0.020），P<0.05] and MMP-9[（0.463±0.003） vs （0.201±0.023），P<0.05] were observed in the presence of the experimental group，compared with the control group.Immunofluorescence analysis showed that after a 7-day exposure to CSC，E-cad protein was lost whereas type 1 collagen，Vimentin and MMP-9 proteins were acquired.Conclusion：CSC exposure can induce EMT-like process in human airway epithelial cells.
【Key words】 Cigarette smoke condensate； Bronchial epithelial cell； Epithelial-mesenchymal transition
First-author’s address：Guangzhou First People’s Hospital，Guangzhou 510180，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.23.008
氣道重塑是慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）的主要病理特征和引起不可逆性气流受限的主要原因之一[1]，其中上皮间充质转分化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）与气道重构密切相关[2]，EMT通过使气道壁中的成纤维细胞增加，从而参与气道重构。吸烟是公认的导致COPD发病和不可逆气流受限进展的最为重要的致病因素[3]。最近研究发现，香烟烟雾凝集物（Cigarette Smoke Condense，CSC）能诱导人气道上皮细胞（Human Bronchial Epittielial Cell，16HBE）发生类似EMT的改变[4]。由此推断，EMT可能是吸烟致COPD气道重构的重要机制之一。CSC可能经由EMT获得成纤维细胞样表型，促进气道重构的发生发展。因此，本研究将16HBE暴露于CSC后，通过观察其对16HBE细胞形态的影响及其EMT相关标志物表达的改变，为EMT在烟草烟雾暴露致COPD气道重构中的可能作用进行初步研究。现报道如下。 1 材料与方法
1.1 实验材料 采用由广州医学院实验中心提供的人正常气道上皮细胞株（Human Bronchial Epittielial Cell，16HBE）。美国GIBCO公司生产的DMEM细胞培养液、胎牛血清（FBS）。日本同仁化学研究所生产的细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8，CCKit-8）试剂。Western blot发光试剂盒为美国Millipore公司产品，GAPDH兔源性多克隆抗体购于美国Biovision公司，E-cad、COL1及MMP-9抗体购自美国SantaCruz公司，Vimentin抗体和核染色液DEPI为Sigma公司产品，辣根酶标记山羊抗鼠IgG二抗及辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗均购于北京华肽先锋生物科技公司，Alexa Fluor488标记（绿色荧光）羊抗小鼠IgG工作液及Alexa Fluor594标记（红色荧光）羊抗兔IgG工作液均购自美国生命公司。
1.2 实验分组 将实验分成两组，对照组和实验组。对照组为未经任何处理的16HBE，实验组即CSC刺激组。各组实验至少重复3次，取其平均值。
1.3 实验方法
1.3.1 CSC的制备 用于CSC制备的香烟由红云红河烟草有限公司生产，长为84 mm，直径为8 mm，焦油含量12 mg/支，烟碱含量1.2 mg/支。将内附玻璃纤维滤膜（Cambridge filter pad，其粗糙面朝向过滤嘴一端）的过滤器两边连上胶管，一端连接一支香烟后点燃，另一端接上60 mL注射器。将吸入的烟雾有规律地推进过滤器和注射器。一共抽吸2支香烟，每支烟吸5 min，负压吸引。抽吸完毕，卸下膜置于皿中，用1 mL移液枪将100%DMSO滴加于膜上，溶解凝聚物，滴加后摇晃25 min，用枪头将溶解液吸尽，所得溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，移入离心管中，12 000 r/min，离心5 min，弃上清，用1 mL的100%DMSO重悬后称重（重悬前已称得1 mL的100%DMSO质量），溶解前后DMSO质量相减，得出溶解后凝集物的质量（g）。把凝集物溶液配成10 mg/mL作为CSC原液，分装，置于-80 ℃保存，备用。
1.3.2 CCKit-8法检测细胞活性 进行干预前将细胞接种于96孔培养板中，接种密度为1.5×104个/孔，使得次日进行干预时细胞融合达60%。24 h后，将细胞用磷酸盐缓冲液洗2次，分别加入不同浓度的CSC后继续培养7 d。在倒置显微镜下观察细胞形态，然后向培养板加入CCK8溶液（10 μL/每孔），放入5%CO2和37 ℃饱和湿度培养箱内培养4 h后取出，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测量各孔的光吸收值（OD值）。根据各个孔的OD值，计算细胞活性（%），细胞活性（%）=（实验组OD均值-空白孔OD均值）/（对照孔OD均值-空白孔OD均值）×100%。OD值的测量精度为小数点后三位，按单因素方差分析法进行统计分析。
1.3.3 EMT有关指标检测 干预前24 h将细胞接种于6孔板中，接种密度为1×105个/孔，使得次日进行干预时细胞融合达60%。加入10 μg/mL的CSC继续培养7 d。Western-blot法测定：收集细胞提取蛋白，蛋白定量后，以20 μg/孔上样，将样本经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离胶进行分离后，将胶转印至硝酸纤维素膜上。转膜结束，条带放入3%脱脂奶粉TBST（1%的Tween20-Tris缓冲液）中，放置摇床1 h即封闭结束。加入一抗前先按比例稀释，小鼠抗人E-cad和兔抗人COL1按1∶1000用3%BSA稀释，小鼠抗人MMP-9按1∶500用3%BSA稀释，内参兔源性多克隆抗体GAPDH按1∶10 000用3%BSA稀释，然后孵育4 ℃过夜。一抗孵育结束，室温下用TBST洗4次，每次5 min，再用TBS洗1次，每次
5 min。加二抗（辣根酶標羊抗鼠IgG，1∶10 000或辣根酶标羊抗兔IgG，1∶10 000）室温下孵育40 min，TBST和TBS洗如前，化学增敏发光法显影。应用Image J软件图像分析系统获得各条带光密度值，蛋白质的相对含量以目的蛋白与内参条带光密度的比值表示，按计量资料进行统计分析。细胞免疫荧光技术检测法：将细胞接种于12孔板，刺激7 d后，将细胞取出，用PBS液洗3次，加入1∶1甲醇丙酮混合液，室温下20 min，然后用PBS洗3次，每次5 min，加入0.5%的Triton X-100，室温10 min；加入5% BSA液室温30 min后，吸尽BSA封闭液，分别滴加稀释一抗即小鼠抗人E-cad抗体（1∶50）、兔抗人COL1抗体（1∶100）、小鼠抗人Vimentin抗体（1∶50）及小鼠抗人MMP-9抗体（1∶200），
-4 ℃过夜。阴性对照组用PBS液代替上述一抗进行反应。用0.5%的Triton X-100于脱色摇床上冲洗细胞6次，每次5 min后，加入Alexa Fluor488标记（绿色荧光）羊抗小鼠IgG工作液（1∶250）或Alexa Fluor594标记（红色荧光）的羊抗兔IgG工作液（1∶250），避光条件下室温40 min。0.5%的Triton X-100洗同前，加入稀释核染色液DEPI（1∶1000），室温15 min，避光。0.5%的Triton X-100洗3次，每次5 min，取作好标记的干净普通载玻片，其上滴加抗荧光淬灭剂（Invitrogen公司）10 μL，小心夹出爬片，细胞面朝下置于有抗淬灭剂的载玻片上，
-4 ℃避光过夜。运用Axio Imager Z2显微扫描分析系统，在400倍高倍镜视野下进行观察。
1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，各组实验至少重复3次，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 不同梯度浓度CSC刺激下16HBE细胞活性检
测 实验第一步：首先从较宽浓度（5×10-3～50 μg/mL）
筛选出对细胞有效影响范围浓度。由表1可见，CSC在5 μg/mL对16HBE细胞有明显促增殖作用（F=274.61，P<0.05），在50 μg/mL对其活性有显著抑制作用（F=94.10，P<0.05），因此进一步细化有效刺激浓度，范围在5～50 μg/mL，刺激7 d后再行CCKit-8检测。实验第二步：从细化后的有效刺激浓度筛选出最佳刺激浓度。由表2可见，CSC在10 μg/mL时OD值达到峰值（F=122.69，P<0.05），在此峰值以后OD值下降（F=298.65、445.28、401.18，P<0.05），故将10 μg/mL作为最佳刺激浓度用于后续实验研究。
2.2 CSC刺激后16HBE形态学检测 经倒置显微镜下观察，对照组16HBE呈现上皮细胞典型的铺路石状形态，细胞间紧密连接，其形态是立体的，稍微凸起的，见图1；而经10 μg/mL CSC刺激7 d后，16HBE细胞间连接明显减少，部分细胞形态发生改变，变为长梭形、多角形或星形，见图2（刺激组中选取EMT样改变最典型区域）。
2.3 CSC刺激后EMT相关标志物表达 Western blot法检测，由表3及图3可见：10 μg/mL 实验组E-cad蛋白表达量（0.301±0.041）较之对照组（0.591±0.068）明显减低，差异有统计学意义（F=0.462，P<0.05）；COL1蛋白表达量（0.566±0.011）较之对照组（0.272±0.020）明显增高，差异有统计学意义（F=0.622，P<0.05）；MMP-9蛋白表达量（0.463±0.003）较之对照组（0.201±0.023）明显增高，差异有统计学意义（F=2.974，P<0.05）。
2.4 CSC刺激后EMT相关标志物表达细胞免疫荧光技术检测 由图4～11可见：16HBE细胞经10 μg/mL
CSC刺激后，与对照组相比，E-cad蛋白表达量减少（绿色荧光在胞膜着色减少），COL1蛋白表达量增加（红色荧光在胞浆着色增加），Vimentin蛋白表达量增加（绿色荧光在胞浆着色增加），MMP-9蛋白表达量增加（绿色荧光在胞浆着色增加）。
3 讨论
慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一种具有气流受限特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展。气道重构（Airway Remodeling）是COPD主要病理特点之一，结果可引起气道阻塞和肺的弹性回缩力下降，在气流受限中扮演非常重要的角色。COPD气道重塑的特征包括鳞状和杯状细胞的化生、黏液腺的肥大和上皮下的纤维化，其中以纤维化为最主要病变[5]。
吸烟已被公认为COPD发病的一个重要危险因素。一般认为，烟草烟雾进入气道后首先引起气道上皮的防御反应，导致许多炎症细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞、CD8+T细胞、上皮细胞等）的集聚活化，并通过自分泌和旁分泌方式释放各种细胞因子、炎症因子和介质和蛋白酶作用于气道结构细胞，引起气道结构细胞的形态和功能的变化。最近研究指出，在吸烟的COPD患者中，其气道网状基底膜断裂较之不吸烟的正常对照更为明显，上皮细胞穿过断裂的基底膜并分化成为肌纤维细胞[6]，然而关于CSC通过何种机制诱导上皮细胞发生纤维化，从而参与COPD气道重构的研究甚少。
上皮间充质转化（EMT）是指在胚胎发育、肿瘤转移或组织纤维化过程中发生的上皮细胞脱黏附而转变成具迁移能力的间质细胞的现象[7-9]。其病理变化主要包括破坏后缺陷的上皮修复、过多的纤维细胞和肌纤维母细胞，胶原的过度产生和纤维化的发生[10]。EMT作为COPD气道重塑的重要机制之一，近年来越来越受到重视[11-14]。其与肺纤维化关系密切，是肺纤维化局部成纤维细胞的重要来源[15]。由于EMT，上皮细胞转化为活动的成纤维细胞，进一步发展成为肌成纤维细胞，使纤维细胞数量增加[2]，从而参与气道重构。最近报道指出，CSC能诱导人气道上皮细胞发生类似EMT的改變[4]。体外实验证实，在CSC刺激下，A549（人肺腺癌细胞）能够呈现转分化表型[16]。最近研究报道，香烟烟雾提取物可诱导正常人支气管上皮细胞（BEAS-2B）发生EMT[17]。由此推测，CSC可能诱导人气道上皮细胞发生EMT样改变，从而使气道上皮细胞获得成纤维细胞样表型，促进气道重构发展。因此，EMT可能是吸烟致COPD气道结构重构的重要机制之一。
正常的上皮细胞表型具有结构和功能上的极性，细胞之间紧密连接，其中E钙黏蛋白（E-cadherin）是粘附连接的主要成分，特别是上皮细胞的连接[18]。在EMT过程中，细胞与细胞间接触减少，细胞的连接被拆卸，E钙黏蛋白从细胞连接中移位，表达减少，F-肌动蛋白和β-连环蛋白连接减少，细胞角蛋白丢失，出现间充质和肌成纤维细胞特有标志如波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白等[19]。在纤维化过程中，细胞外基质（ECM）形成和降解的生理学平衡被打乱，与基质流动和生长因子激活有关的基质金属蛋白酶（如MMP-2、MMP-9）均显示上调[20]。本研究选择几个有代表性的，与EMT改变密切相关的指标（如MMP-9、1型胶原）进行检测，从研究结果可以看出，烟草烟雾暴露于人气道上皮细胞（16HBE）后，能刺激其发生类似EMT的改变，这与文献[4]的报道一致。刺激后的16HBE虽然没有真正成为成纤维细胞，但从其形态变化、EMT标志物表达变化上分析，整体倾向于向成纤维细胞发展。然而，人体是一个复杂的有机体，而EMT又是一非常复杂的过程，上皮细胞短期暴露不可能完全转变为成纤维细胞，所以在本研究中只能看到其向成纤维细胞改变的趋势。由此，进一步开展其体内试验的研究非常有必要。本实验表明，CSC刺激16HBE细胞7 d后，无论是细胞形态还是基因表达都向EMT样的改变发展，标记物表达与细胞形态学改变均符合EMT样的转变，这可能为香烟烟雾暴露致COPD气道重塑的发病机制提供线索。但由于香烟及其烟雾中含有3800多种化合物，其有害物质组分复杂，关于烟草烟雾何种成分在其中发挥主要作用，研究甚少。尼古丁是烟草中的主要致成瘾成分，且在香烟烟雾中的含量较高，最近有研究推测[21]，尼古丁可能通过诱导上皮细胞转分化参与吸烟所致COPD患者气道重构，因此关于其有害成分的体外试验研究仍有待进一步开展。 参考文献
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（收稿日期：2017-03-27） （本文编辑：程旭然）
10 μg/mL时OD值最高，为（2.562±0.045）。各浓度间OD值比较差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）经10 μg/mL CSC刺激后，部分16HBE形态由鹅卵石状向长梭形、多角形或星形改变。（3）Western-blot检测发现试验组COL1、MMP-9的蛋白表达量分别为（0.566±0.011）和（0.463±0.003），高于对照组（0.272±0.020）和（0.201±0.023），差异均有统计学意义（P<0.05）；而E-cad蛋白表达量则明显低于对照组，分别为（0.301±0.041）和（0.591±0.068），差异有统计学意义（P<0.05）。（4）细胞免疫荧光检测发现试验组COL1、Vimentin和MMP-9蛋白表达量均高于对照组（P<0.05）；而E-cad蛋白表达量明显低于对照组（P<0.05）。结论：经CSC刺激后，16HBE可出现转分化样改变。
【关键词】 烟草烟雾凝集物； 气道上皮细胞； 上皮细胞间充质转分化
【Abstract】 Objective：To observe the epithelial-mesenchymal transition in human bronchial epithelial cells（16HBE） exposed to cigarette smoke.Method：Cells were stimulated by cigarrette smoke condensate（CSC） with different concentrations（5-50 μg/mL） for 7 days，then chosen the optimal concentration by cell counting kit-8.Western blot and Immunofluorescence method were used to estimate the expression levels of E-cad，type 1 collagen，Vimentin and MMP-9 in 16HBE induced with CSC （10 μg/mL） for 7 days.Result：16HBE manifested a morphological characteristic of loss of cell-cell contact and elongated shape，after 7 days induced with CSC.The level of E-cad downregulated in the experimental group[Western blot（0.301±0.041） vs （0.591±0.068），P<0.05].In contrast，upregulations in expression of type 1 collagen[Western blot （0.566±0.011） vs （0.272±0.020），P<0.05] and MMP-9[（0.463±0.003） vs （0.201±0.023），P<0.05] were observed in the presence of the experimental group，compared with the control group.Immunofluorescence analysis showed that after a 7-day exposure to CSC，E-cad protein was lost whereas type 1 collagen，Vimentin and MMP-9 proteins were acquired.Conclusion：CSC exposure can induce EMT-like process in human airway epithelial cells.
【Key words】 Cigarette smoke condensate； Bronchial epithelial cell； Epithelial-mesenchymal transition
First-author’s address：Guangzhou First People’s Hospital，Guangzhou 510180，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.23.008
氣道重塑是慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）的主要病理特征和引起不可逆性气流受限的主要原因之一[1]，其中上皮间充质转分化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）与气道重构密切相关[2]，EMT通过使气道壁中的成纤维细胞增加，从而参与气道重构。吸烟是公认的导致COPD发病和不可逆气流受限进展的最为重要的致病因素[3]。最近研究发现，香烟烟雾凝集物（Cigarette Smoke Condense，CSC）能诱导人气道上皮细胞（Human Bronchial Epittielial Cell，16HBE）发生类似EMT的改变[4]。由此推断，EMT可能是吸烟致COPD气道重构的重要机制之一。CSC可能经由EMT获得成纤维细胞样表型，促进气道重构的发生发展。因此，本研究将16HBE暴露于CSC后，通过观察其对16HBE细胞形态的影响及其EMT相关标志物表达的改变，为EMT在烟草烟雾暴露致COPD气道重构中的可能作用进行初步研究。现报道如下。 1 材料与方法
1.1 实验材料 采用由广州医学院实验中心提供的人正常气道上皮细胞株（Human Bronchial Epittielial Cell，16HBE）。美国GIBCO公司生产的DMEM细胞培养液、胎牛血清（FBS）。日本同仁化学研究所生产的细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8，CCKit-8）试剂。Western blot发光试剂盒为美国Millipore公司产品，GAPDH兔源性多克隆抗体购于美国Biovision公司，E-cad、COL1及MMP-9抗体购自美国SantaCruz公司，Vimentin抗体和核染色液DEPI为Sigma公司产品，辣根酶标记山羊抗鼠IgG二抗及辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗均购于北京华肽先锋生物科技公司，Alexa Fluor488标记（绿色荧光）羊抗小鼠IgG工作液及Alexa Fluor594标记（红色荧光）羊抗兔IgG工作液均购自美国生命公司。
1.2 实验分组 将实验分成两组，对照组和实验组。对照组为未经任何处理的16HBE，实验组即CSC刺激组。各组实验至少重复3次，取其平均值。
1.3 实验方法
1.3.1 CSC的制备 用于CSC制备的香烟由红云红河烟草有限公司生产，长为84 mm，直径为8 mm，焦油含量12 mg/支，烟碱含量1.2 mg/支。将内附玻璃纤维滤膜（Cambridge filter pad，其粗糙面朝向过滤嘴一端）的过滤器两边连上胶管，一端连接一支香烟后点燃，另一端接上60 mL注射器。将吸入的烟雾有规律地推进过滤器和注射器。一共抽吸2支香烟，每支烟吸5 min，负压吸引。抽吸完毕，卸下膜置于皿中，用1 mL移液枪将100%DMSO滴加于膜上，溶解凝聚物，滴加后摇晃25 min，用枪头将溶解液吸尽，所得溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，移入离心管中，12 000 r/min，离心5 min，弃上清，用1 mL的100%DMSO重悬后称重（重悬前已称得1 mL的100%DMSO质量），溶解前后DMSO质量相减，得出溶解后凝集物的质量（g）。把凝集物溶液配成10 mg/mL作为CSC原液，分装，置于-80 ℃保存，备用。
1.3.2 CCKit-8法检测细胞活性 进行干预前将细胞接种于96孔培养板中，接种密度为1.5×104个/孔，使得次日进行干预时细胞融合达60%。24 h后，将细胞用磷酸盐缓冲液洗2次，分别加入不同浓度的CSC后继续培养7 d。在倒置显微镜下观察细胞形态，然后向培养板加入CCK8溶液（10 μL/每孔），放入5%CO2和37 ℃饱和湿度培养箱内培养4 h后取出，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测量各孔的光吸收值（OD值）。根据各个孔的OD值，计算细胞活性（%），细胞活性（%）=（实验组OD均值-空白孔OD均值）/（对照孔OD均值-空白孔OD均值）×100%。OD值的测量精度为小数点后三位，按单因素方差分析法进行统计分析。
1.3.3 EMT有关指标检测 干预前24 h将细胞接种于6孔板中，接种密度为1×105个/孔，使得次日进行干预时细胞融合达60%。加入10 μg/mL的CSC继续培养7 d。Western-blot法测定：收集细胞提取蛋白，蛋白定量后，以20 μg/孔上样，将样本经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离胶进行分离后，将胶转印至硝酸纤维素膜上。转膜结束，条带放入3%脱脂奶粉TBST（1%的Tween20-Tris缓冲液）中，放置摇床1 h即封闭结束。加入一抗前先按比例稀释，小鼠抗人E-cad和兔抗人COL1按1∶1000用3%BSA稀释，小鼠抗人MMP-9按1∶500用3%BSA稀释，内参兔源性多克隆抗体GAPDH按1∶10 000用3%BSA稀释，然后孵育4 ℃过夜。一抗孵育结束，室温下用TBST洗4次，每次5 min，再用TBS洗1次，每次
5 min。加二抗（辣根酶標羊抗鼠IgG，1∶10 000或辣根酶标羊抗兔IgG，1∶10 000）室温下孵育40 min，TBST和TBS洗如前，化学增敏发光法显影。应用Image J软件图像分析系统获得各条带光密度值，蛋白质的相对含量以目的蛋白与内参条带光密度的比值表示，按计量资料进行统计分析。细胞免疫荧光技术检测法：将细胞接种于12孔板，刺激7 d后，将细胞取出，用PBS液洗3次，加入1∶1甲醇丙酮混合液，室温下20 min，然后用PBS洗3次，每次5 min，加入0.5%的Triton X-100，室温10 min；加入5% BSA液室温30 min后，吸尽BSA封闭液，分别滴加稀释一抗即小鼠抗人E-cad抗体（1∶50）、兔抗人COL1抗体（1∶100）、小鼠抗人Vimentin抗体（1∶50）及小鼠抗人MMP-9抗体（1∶200），
-4 ℃过夜。阴性对照组用PBS液代替上述一抗进行反应。用0.5%的Triton X-100于脱色摇床上冲洗细胞6次，每次5 min后，加入Alexa Fluor488标记（绿色荧光）羊抗小鼠IgG工作液（1∶250）或Alexa Fluor594标记（红色荧光）的羊抗兔IgG工作液（1∶250），避光条件下室温40 min。0.5%的Triton X-100洗同前，加入稀释核染色液DEPI（1∶1000），室温15 min，避光。0.5%的Triton X-100洗3次，每次5 min，取作好标记的干净普通载玻片，其上滴加抗荧光淬灭剂（Invitrogen公司）10 μL，小心夹出爬片，细胞面朝下置于有抗淬灭剂的载玻片上，
-4 ℃避光过夜。运用Axio Imager Z2显微扫描分析系统，在400倍高倍镜视野下进行观察。
1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，各组实验至少重复3次，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 不同梯度浓度CSC刺激下16HBE细胞活性检
测 实验第一步：首先从较宽浓度（5×10-3～50 μg/mL）
筛选出对细胞有效影响范围浓度。由表1可见，CSC在5 μg/mL对16HBE细胞有明显促增殖作用（F=274.61，P<0.05），在50 μg/mL对其活性有显著抑制作用（F=94.10，P<0.05），因此进一步细化有效刺激浓度，范围在5～50 μg/mL，刺激7 d后再行CCKit-8检测。实验第二步：从细化后的有效刺激浓度筛选出最佳刺激浓度。由表2可见，CSC在10 μg/mL时OD值达到峰值（F=122.69，P<0.05），在此峰值以后OD值下降（F=298.65、445.28、401.18，P<0.05），故将10 μg/mL作为最佳刺激浓度用于后续实验研究。
2.2 CSC刺激后16HBE形态学检测 经倒置显微镜下观察，对照组16HBE呈现上皮细胞典型的铺路石状形态，细胞间紧密连接，其形态是立体的，稍微凸起的，见图1；而经10 μg/mL CSC刺激7 d后，16HBE细胞间连接明显减少，部分细胞形态发生改变，变为长梭形、多角形或星形，见图2（刺激组中选取EMT样改变最典型区域）。
2.3 CSC刺激后EMT相关标志物表达 Western blot法检测，由表3及图3可见：10 μg/mL 实验组E-cad蛋白表达量（0.301±0.041）较之对照组（0.591±0.068）明显减低，差异有统计学意义（F=0.462，P<0.05）；COL1蛋白表达量（0.566±0.011）较之对照组（0.272±0.020）明显增高，差异有统计学意义（F=0.622，P<0.05）；MMP-9蛋白表达量（0.463±0.003）较之对照组（0.201±0.023）明显增高，差异有统计学意义（F=2.974，P<0.05）。
2.4 CSC刺激后EMT相关标志物表达细胞免疫荧光技术检测 由图4～11可见：16HBE细胞经10 μg/mL
CSC刺激后，与对照组相比，E-cad蛋白表达量减少（绿色荧光在胞膜着色减少），COL1蛋白表达量增加（红色荧光在胞浆着色增加），Vimentin蛋白表达量增加（绿色荧光在胞浆着色增加），MMP-9蛋白表达量增加（绿色荧光在胞浆着色增加）。
3 讨论
慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一种具有气流受限特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展。气道重构（Airway Remodeling）是COPD主要病理特点之一，结果可引起气道阻塞和肺的弹性回缩力下降，在气流受限中扮演非常重要的角色。COPD气道重塑的特征包括鳞状和杯状细胞的化生、黏液腺的肥大和上皮下的纤维化，其中以纤维化为最主要病变[5]。
吸烟已被公认为COPD发病的一个重要危险因素。一般认为，烟草烟雾进入气道后首先引起气道上皮的防御反应，导致许多炎症细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞、CD8+T细胞、上皮细胞等）的集聚活化，并通过自分泌和旁分泌方式释放各种细胞因子、炎症因子和介质和蛋白酶作用于气道结构细胞，引起气道结构细胞的形态和功能的变化。最近研究指出，在吸烟的COPD患者中，其气道网状基底膜断裂较之不吸烟的正常对照更为明显，上皮细胞穿过断裂的基底膜并分化成为肌纤维细胞[6]，然而关于CSC通过何种机制诱导上皮细胞发生纤维化，从而参与COPD气道重构的研究甚少。
上皮间充质转化（EMT）是指在胚胎发育、肿瘤转移或组织纤维化过程中发生的上皮细胞脱黏附而转变成具迁移能力的间质细胞的现象[7-9]。其病理变化主要包括破坏后缺陷的上皮修复、过多的纤维细胞和肌纤维母细胞，胶原的过度产生和纤维化的发生[10]。EMT作为COPD气道重塑的重要机制之一，近年来越来越受到重视[11-14]。其与肺纤维化关系密切，是肺纤维化局部成纤维细胞的重要来源[15]。由于EMT，上皮细胞转化为活动的成纤维细胞，进一步发展成为肌成纤维细胞，使纤维细胞数量增加[2]，从而参与气道重构。最近报道指出，CSC能诱导人气道上皮细胞发生类似EMT的改變[4]。体外实验证实，在CSC刺激下，A549（人肺腺癌细胞）能够呈现转分化表型[16]。最近研究报道，香烟烟雾提取物可诱导正常人支气管上皮细胞（BEAS-2B）发生EMT[17]。由此推测，CSC可能诱导人气道上皮细胞发生EMT样改变，从而使气道上皮细胞获得成纤维细胞样表型，促进气道重构发展。因此，EMT可能是吸烟致COPD气道结构重构的重要机制之一。
正常的上皮细胞表型具有结构和功能上的极性，细胞之间紧密连接，其中E钙黏蛋白（E-cadherin）是粘附连接的主要成分，特别是上皮细胞的连接[18]。在EMT过程中，细胞与细胞间接触减少，细胞的连接被拆卸，E钙黏蛋白从细胞连接中移位，表达减少，F-肌动蛋白和β-连环蛋白连接减少，细胞角蛋白丢失，出现间充质和肌成纤维细胞特有标志如波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白等[19]。在纤维化过程中，细胞外基质（ECM）形成和降解的生理学平衡被打乱，与基质流动和生长因子激活有关的基质金属蛋白酶（如MMP-2、MMP-9）均显示上调[20]。本研究选择几个有代表性的，与EMT改变密切相关的指标（如MMP-9、1型胶原）进行检测，从研究结果可以看出，烟草烟雾暴露于人气道上皮细胞（16HBE）后，能刺激其发生类似EMT的改变，这与文献[4]的报道一致。刺激后的16HBE虽然没有真正成为成纤维细胞，但从其形态变化、EMT标志物表达变化上分析，整体倾向于向成纤维细胞发展。然而，人体是一个复杂的有机体，而EMT又是一非常复杂的过程，上皮细胞短期暴露不可能完全转变为成纤维细胞，所以在本研究中只能看到其向成纤维细胞改变的趋势。由此，进一步开展其体内试验的研究非常有必要。本实验表明，CSC刺激16HBE细胞7 d后，无论是细胞形态还是基因表达都向EMT样的改变发展，标记物表达与细胞形态学改变均符合EMT样的转变，这可能为香烟烟雾暴露致COPD气道重塑的发病机制提供线索。但由于香烟及其烟雾中含有3800多种化合物，其有害物质组分复杂，关于烟草烟雾何种成分在其中发挥主要作用，研究甚少。尼古丁是烟草中的主要致成瘾成分，且在香烟烟雾中的含量较高，最近有研究推测[21]，尼古丁可能通过诱导上皮细胞转分化参与吸烟所致COPD患者气道重构，因此关于其有害成分的体外试验研究仍有待进一步开展。 参考文献
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（收稿日期：2017-03-27） （本文编辑：程旭然）