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摘要：姬蛙是一大类常见的农田物种，通常个体较小，蝌蚪间差异不明显，难以准确鉴定。本研究对采自贵州省黔东南州麻江县姬蛙类蝌蚪标本进行DNA提取，使用PCR技术扩增线粒体16S rRNA基因片段，参照GenBank中同源序列的系统发育关系对其进行初步分子鉴定。结果表明，标本16S rRNA基因片段与27条小弧斑姬蛙（Microhyla heymonsi）同源序列聚为一个单系，该单系内部序列间遗传距离小于本研究所用参考序列的种间遗传距离，因此，初步鉴定标本为小弧斑姬蛙蝌蚪。同时，本研究中小弧斑姬蛙支系的序列间遗传距离略高于所有参考序列的种内遗传距离，并且在单倍型网络中被分割为6个独立网络，暗示分布广泛的小弧斑姬蛙种内存在较大的支系分化。另外，本研究对参考序列中的可疑序列进行了初步探讨。
关键词：小弧斑姬蛙;16S rRNA基因;克隆;分子鉴定;可疑序列
小弧斑姬蛙（Microhyla heymonsi），隶属姬蛙科（Microhylidae）、姬蛙属（Microhyla）[1]，是常见的农田蛙类。因其具有多样的环境适应能力，而广泛分布于中国、印度、缅甸、泰国、老挝、越南、柬埔寨、马来半岛、印度尼西亚等地区[1-2]。国内主要分布于四川、重庆、云南、贵州、河南、安徽、江苏、浙江、江西、湖南、福建、台湾、广东、海南、广西等地区[1]。小弧斑姬蛙在贵州省内多地均有分布，如绥阳、仁怀、赤水、大方、金沙、江口、印江、松桃、贵阳、贵定、荔渡、罗甸、雷山、兴义、安龙、德江、剑河等地区[3]。然而，目前并没有明确的文献记载该物种在麻江县是否有分布。2016年6月，笔者于贵州省黔东南州麻江县坝芒乡采集到疑似小弧斑姬蛙蝌蚪标本3号，但因蝌蚪较小，形态特征不明显，且与贵州分布的其他姬蛙蝌蚪极为相似，因此有必要对该标本使用分子鉴定手段作进一步的物种鉴定。本研究拟对所采集的姬蛙蝌蚪标本进行DNA提取，扩增其线粒体16S rRNA基因（以下简称16S基因），并进行系统发育分析从而对其物种归属进行初步鉴定。
1 材料与方法
1.1 标本信息
小弧斑姬蛙标本为2016年6月25日采自贵州省黔东南州麻江县坝芒乡的3个蝌蚪幼体，保存于六盘水师范学院生物科学与技术学院动物标本馆。参考序列[4-11]见表1。
1.2 总DNA提取及线粒体16S rRNA基因片段扩增
取蝌蚪尾部肌肉，使用动物组织DNA提取试剂盒（Foregene，DE-05011：250 Preps）提取总DNA。扩增引物为1对脊椎动物线粒体16S基因片段扩增通用引物（P7/P8）[12-13]。PCR反应条件与华西雨蛙、寒露林蛙同源基因扩增条件相同[13-14]，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。
1.3 参考基因序列下载及系统发育分析
将所测得的小弧斑姬蛙线粒体16S基因序列经过上传GenBank进行搜索比对（Mega Blast）获得100条参考序列，与本研究所得基因序列一起构成数据集A。用Muscle软件[15]对序列进行比对，在Mtga X[16]中辅以人工校对并将首尾不整齐片段删除。进行系统发育分析时不预先设定外群，构建无根系统发育树。使用jModel Test[17]中赤池信息量准则（akaike information criterion，简称AIC）筛选适合数据集A的最优模型，并使用相应的最优模型树（best model tree）作为拓扑结构基准。根据AIC，适合该数据集的模型为GTR I G模型，其中 G=0.885，I=0.605。使用raxmlGUI软件[18]构建最大似然树（maximum likelihood tree，简称ML tree），自举检验支持率
关键词：小弧斑姬蛙;16S rRNA基因;克隆;分子鉴定;可疑序列
小弧斑姬蛙（Microhyla heymonsi），隶属姬蛙科（Microhylidae）、姬蛙属（Microhyla）[1]，是常见的农田蛙类。因其具有多样的环境适应能力，而广泛分布于中国、印度、缅甸、泰国、老挝、越南、柬埔寨、马来半岛、印度尼西亚等地区[1-2]。国内主要分布于四川、重庆、云南、贵州、河南、安徽、江苏、浙江、江西、湖南、福建、台湾、广东、海南、广西等地区[1]。小弧斑姬蛙在贵州省内多地均有分布，如绥阳、仁怀、赤水、大方、金沙、江口、印江、松桃、贵阳、贵定、荔渡、罗甸、雷山、兴义、安龙、德江、剑河等地区[3]。然而，目前并没有明确的文献记载该物种在麻江县是否有分布。2016年6月，笔者于贵州省黔东南州麻江县坝芒乡采集到疑似小弧斑姬蛙蝌蚪标本3号，但因蝌蚪较小，形态特征不明显，且与贵州分布的其他姬蛙蝌蚪极为相似，因此有必要对该标本使用分子鉴定手段作进一步的物种鉴定。本研究拟对所采集的姬蛙蝌蚪标本进行DNA提取，扩增其线粒体16S rRNA基因（以下简称16S基因），并进行系统发育分析从而对其物种归属进行初步鉴定。
1 材料与方法
1.1 标本信息
小弧斑姬蛙标本为2016年6月25日采自贵州省黔东南州麻江县坝芒乡的3个蝌蚪幼体，保存于六盘水师范学院生物科学与技术学院动物标本馆。参考序列[4-11]见表1。
1.2 总DNA提取及线粒体16S rRNA基因片段扩增
取蝌蚪尾部肌肉，使用动物组织DNA提取试剂盒（Foregene，DE-05011：250 Preps）提取总DNA。扩增引物为1对脊椎动物线粒体16S基因片段扩增通用引物（P7/P8）[12-13]。PCR反应条件与华西雨蛙、寒露林蛙同源基因扩增条件相同[13-14]，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。
1.3 参考基因序列下载及系统发育分析
将所测得的小弧斑姬蛙线粒体16S基因序列经过上传GenBank进行搜索比对（Mega Blast）获得100条参考序列，与本研究所得基因序列一起构成数据集A。用Muscle软件[15]对序列进行比对，在Mtga X[16]中辅以人工校对并将首尾不整齐片段删除。进行系统发育分析时不预先设定外群，构建无根系统发育树。使用jModel Test[17]中赤池信息量准则（akaike information criterion，简称AIC）筛选适合数据集A的最优模型，并使用相应的最优模型树（best model tree）作为拓扑结构基准。根据AIC，适合该数据集的模型为GTR I G模型，其中 G=0.885，I=0.605。使用raxmlGUI软件[18]构建最大似然树（maximum likelihood tree，简称ML tree），自举检验支持率