探讨乙型肝炎病毒X基因(HBx)转染人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞株后对其表达Notch1受体的影响,并观察Notch1受体在HBx介导的肾小管上皮细胞增殖、凋亡中的作用。
方法用分子克隆的方法构建pcDNA3.1/myc-HBx质粒及pcDNA3.1/myc-Notch1质粒,转染HK-2细胞建立转染株,并应用短发夹RNA(shRNA)干扰技术沉默Notch1基因表达。将细胞分为7组:①正常培养组;②转染HBx空载质粒组;③转染HBx质粒组;④转染HBx质粒+Notch1空载质粒组;⑤转染HBx质粒+Notch1质粒组;⑥转染HBx质粒+Notch1 shRNA空载质粒组;⑦转染HBx质粒+Notch1 shRNA沉默质粒组。实时定量PCR和Western印迹法验证HBx转染成功,检测细胞中Notch1受体的变化,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测各组细胞的生长抑制率,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。
结果HK-2细胞经转染HBx基因后可高表达HBx,Notch1 shRNA在HK-2细胞中的转染效率也高达70%,基因沉默有效;转染HBx基因组细胞Notch1水平明显高于正常培养组及转染HBx空载质粒组,且该组细胞凋亡率亦明显高于正常培养组及转染HBx空载质粒组,差异均有统计学意义(14.94%±0.32%比13.86%±0.18%、13.67%±0.54%,均P<0.05)。转染HBx质粒+Notch1质粒组细胞凋亡率明显低于HBx质粒+Notch1空载质粒组,差异有统计学意义(10.10%±0.26%比14.79%±0.02%,P<0.05),其细胞增殖抑制率亦低于HBx质粒+Notch1空载质粒组。而转染HBx质粒+Notch1 shRNA沉默质粒组细胞凋亡率及细胞增殖抑制率均高于HBx质粒+Notch1 shRNA空载质粒组(均P<0.05)。
结论构建pcDNA3.1/myc-HBx质粒并转染肾小管上皮细胞可成功制备乙型肝炎病毒细胞感染模型,由此导致的肾小管上皮细胞生长抑制及凋亡增加可能与Notch1受体异常活化有关。