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摘要：本实验研究了刺参、鲍鱼（在实验条件下暴露在不同浓度的蒽后，刺参和鲍鱼体内谷胱甘肽酶活性在不同时间段的动态变化情况，并分析了刺参、鲍鱼体内GSH酶活性与蒽浓度之间的剂量、时间-效应之间的关系。结果表明，在实验中海水空白与丙酮对照组之间没有显著差异。在蒽对刺参的污染实验中，笔者发现随着污染物浓度的增加GSH酶活性也增加，并且蒽对GSH酶活性诱导效应最强的时间是在12h。在净化实验中，各污染物浓度组GSH酶活性与对照组相比差异不太明显，说明实验浓度没有严重的超出刺参自身抗氧化系统的能力，在此浓度范围内被污染的刺身可以通过净化实验来恢复自身的抗氧化功能。
关键词：蒽（anthracene）；刺参；鲍鱼；GSH酶活性
1引言
我国由于历史原因对有机物化学药品的重视程度还不够，故相应的研究还比较滞后，相关的资料比较匮乏。尤其是有关难降解有机物的研究更少。由于难降解有机物在环境中的停留时间较长，尤其是在海洋中的停留时间，所以未来对难降解有机物影响的研究将是重点。因此，研究多环芳烃——蒽对海洋生物的致毒效应对于整个海洋生物资源乃至整个海洋生态系统的保护都具有非常重要的意义。
2实验材料
2.1实验生物
刺参、鲍鱼（长约3cm）购自大连海宝生物有限公司，养在循环水养殖系統中每隔三天更换一次新鲜海水，并且每天分别投喂鱼粉和海带。
2.2实验药品
蒽纯度大于99%，购自Sigma试剂公司（Sigma—Aldrich，St.Louis，MO）、其它試剂TCA（三氯乙酸）、Tris、DTNB、丙酮、GSH等均为国产分析纯。
2.3实验仪器
烧杯（1000mL）、10mL比色管、2cm石英比色皿、10～50uL、50～100uL、100～1000uL移液枪三支、镊子、电子称量平、称量纸、擦镜纸、量筒若干、试管架、曝气头、721光分光光度器、25摄氏度水浴箱（一个）、计时器、剪刀、离心机、刻度吸管、试剂瓶、玻璃匀浆管。
2.4海水
取自大连市黑石礁海区，并经砂滤后抽取使用。温度为14±1℃，pH为7.9-8.1，盐度为30。
3实验方法
3.1 GSH标准曲线的绘制
配制25？MGSH储备液，分别取0、0.6、1.2、1.8、2.4、3mL的GSH储备液于6支10mL的比色管中，然后分别向比色管中加入3、2.4、1.8、1.2、0.6、0mL的纯水，混匀后各加100？LTCA，同时加入2mLTris缓冲溶液，在25’C的恒温水浴锅中加热5分钟后在分别加入20uLDTNB，混匀显色25分钟后，分光光度计（波长为415nm）测吸光值（第一个管为对照管），以X轴为GSH的浓度，Y轴为吸光度值（A-A0），制作标准曲线。得到标准曲线方程 y=21.609x+0.0660。
3.2慢性毒性实验
1.将刺参和鲍鱼清洗干净，选取18个1000mL的烧杯中分别加入1000mL海水（每4个烧杯为一组，刺参设置两组平行，鲍鱼不设平行），另外两个烧杯分别为空白和丙酮对照组（对照组投入海参）。并分别在实验组中依次投入蒽使溶液，使每个烧杯中蒽的浓度分别是1、5、10、20 ？g/L，对照组不加蒽溶液（海水对照组不加任何污染物、丙酮对照组加20 ？L的丙酮），并且曝气。
2.从第一次加入蒽试剂开始每隔三天更换一次新鲜海水，并依次按前面的步骤加入药品，直至第14d后不再加入蒽试剂。
3.在实验开始后在2h、6h、12h、24h、48h、4d、7d、21d后分别依次在每个烧杯中取样（刺参每个浓度下取3个，鲍鱼每个浓度取一只），装入小塑料袋放在冰箱中进行冰冻待测。在暴露14d后刺参和鲍鱼在海水中净化一个星期，在第21d再取样观察其自身恢复情况。然后测定刺参和鲍鱼体内GSH酶活性，实验期不投喂。
3.3组织匀浆的制备
将经药物胁迫后的刺参、鲍鱼先进行解冻，然后用剪刀剪碎，并用分析天平称取组织块0.2～1.0g左右，并加入其质量9倍的冷生理盐水，在玻璃匀浆管中充分研磨20次左右（6～8分钟），然后把制备好的组织匀浆用普通离心机4000转/分，离心l5 min，然后取上清液进行GSH酶活性的测定。
3.4酶活性测定
准备18支用纯水清洗干净的10mL比色管，每组4支（海参设置两组平行，鲍鱼不设平行组），另两只为照组。分别加入100uL已经离心好的浓度为1？g/L、5？g/L、10？g/L、20？g/L匀浆上清液，对照组加对应的对照组上清液，然后加入2mLTris缓冲溶液，100？LTCA摇匀后在25℃的恒温水浴锅中加热5分钟后加入100？L2.5mMDTNB混匀显色25分钟后，在415nm处测定其吸光度。
3.5酶活性计算公式
GSH含量=21.609*（A-A0）+0.066
4数据处理
数据用平均值±标准偏差表示。采用Excel、Sigmaplot12.5制作图表，用SPSS19.0软件进行数据分析。显著性差异检验采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验法，相关性分析采用皮尔逊（Pearson）方法，P<0.05 时被认为差异显著，P<0.01 时被认为差异极显著。
5实验结果和分析
5.1 蒽对刺参体内GSH酶活性的影响
在一定浓度蒽的胁迫作用下，GSH酶活性含量是个动态变化的过程 ，蒽浓度和时间是影响GSH酶活性的重要因素。
在剂量一效应关系面，刺参体内GSH酶活性的含量随着蒽浓度的增加而上升，但只有在2h和24h时有较为显著的线性关系。高浓度时蒽对GSH酶活性的诱导效应高于低浓度时的诱导效应。但是在有蒽胁迫的情况下，除了12h以外在其他时候GSH的含量均没有对照组高。在14d时解除暴露后再净化一个星期后GSH酶活性含量又达到了最高值。
5.2蒽对鲍鱼体内GSH酶活性的影响
GSH酶活性含量是个动态变化的过程，蒽浓度和时间是影响GSH酶活性的重要因素。
在时间一效应关系方面，海参体内GSH酶活性在4d内随着时间的延长出现了先升后降再升的趋势，并且在蒽浓度为20？g/L时这种趋势最为明显，而且呈现出很明显的“钟”型变化趋势，并且在12h值达到峰值，这说明表明鲍鱼体内GSH酶活性可在较短的时间内被诱导，而且是在蒽浓度为20？g/L诱导效果最为显著，且诱导效应在初期高于后期。但低浓度组（1、5？g/L）在不同时刻之间的变化不太明显。
6结论
6.1蒽对刺参体内GSH酶活性的影响
在蒽对刺参体内GSH酶活性的影响研究中我们发现，在12h时蒽对刺参体内GSH酶活性的诱导效应最强。而且随着污染物蒽浓度的增加GSH酶活性也增强，在21d时GSH含量恢复到了对照组的值，这说明净化实验能够使刺参体内GSH酶活性恢复到正常水平，这与穆景利，王新红[10]等人关于苯并（a）芘影响黑鲷肝脏EROD活性变化的动力学研究结果正好相同；另一方面也说明，暴露实验没有严重的超出刺参自身的抗氧化系统能力。
6.2蒽对鲍鱼体内GSH酶活性的影响
在蒽对鲍鱼体内GSH酶活性影响的研究中我们发现，随着污染物蒽浓度的递增GSH酶活性依次升高，但在第4d时GSH酶活性已经不随污染物浓度的变化而变化了，这说明此时污染物浓度已经不是影响GSH酶活性的关键因素了。此外我们还发现在污染物蒽浓度为20ug/L时，GSH酶活性出现了先升后降的趋势，并且在12h时GSH酶活性达到了最大值，这说明GSH酶活性可以很好地指示有机污染物对海参的生物响应，而且污染物蒽的响应浓度为20g/L。
关键词：蒽（anthracene）；刺参；鲍鱼；GSH酶活性
1引言
我国由于历史原因对有机物化学药品的重视程度还不够，故相应的研究还比较滞后，相关的资料比较匮乏。尤其是有关难降解有机物的研究更少。由于难降解有机物在环境中的停留时间较长，尤其是在海洋中的停留时间，所以未来对难降解有机物影响的研究将是重点。因此，研究多环芳烃——蒽对海洋生物的致毒效应对于整个海洋生物资源乃至整个海洋生态系统的保护都具有非常重要的意义。
2实验材料
2.1实验生物
刺参、鲍鱼（长约3cm）购自大连海宝生物有限公司，养在循环水养殖系統中每隔三天更换一次新鲜海水，并且每天分别投喂鱼粉和海带。
2.2实验药品
蒽纯度大于99%，购自Sigma试剂公司（Sigma—Aldrich，St.Louis，MO）、其它試剂TCA（三氯乙酸）、Tris、DTNB、丙酮、GSH等均为国产分析纯。
2.3实验仪器
烧杯（1000mL）、10mL比色管、2cm石英比色皿、10～50uL、50～100uL、100～1000uL移液枪三支、镊子、电子称量平、称量纸、擦镜纸、量筒若干、试管架、曝气头、721光分光光度器、25摄氏度水浴箱（一个）、计时器、剪刀、离心机、刻度吸管、试剂瓶、玻璃匀浆管。
2.4海水
取自大连市黑石礁海区，并经砂滤后抽取使用。温度为14±1℃，pH为7.9-8.1，盐度为30。
3实验方法
3.1 GSH标准曲线的绘制
配制25？MGSH储备液，分别取0、0.6、1.2、1.8、2.4、3mL的GSH储备液于6支10mL的比色管中，然后分别向比色管中加入3、2.4、1.8、1.2、0.6、0mL的纯水，混匀后各加100？LTCA，同时加入2mLTris缓冲溶液，在25’C的恒温水浴锅中加热5分钟后在分别加入20uLDTNB，混匀显色25分钟后，分光光度计（波长为415nm）测吸光值（第一个管为对照管），以X轴为GSH的浓度，Y轴为吸光度值（A-A0），制作标准曲线。得到标准曲线方程 y=21.609x+0.0660。
3.2慢性毒性实验
1.将刺参和鲍鱼清洗干净，选取18个1000mL的烧杯中分别加入1000mL海水（每4个烧杯为一组，刺参设置两组平行，鲍鱼不设平行），另外两个烧杯分别为空白和丙酮对照组（对照组投入海参）。并分别在实验组中依次投入蒽使溶液，使每个烧杯中蒽的浓度分别是1、5、10、20 ？g/L，对照组不加蒽溶液（海水对照组不加任何污染物、丙酮对照组加20 ？L的丙酮），并且曝气。
2.从第一次加入蒽试剂开始每隔三天更换一次新鲜海水，并依次按前面的步骤加入药品，直至第14d后不再加入蒽试剂。
3.在实验开始后在2h、6h、12h、24h、48h、4d、7d、21d后分别依次在每个烧杯中取样（刺参每个浓度下取3个，鲍鱼每个浓度取一只），装入小塑料袋放在冰箱中进行冰冻待测。在暴露14d后刺参和鲍鱼在海水中净化一个星期，在第21d再取样观察其自身恢复情况。然后测定刺参和鲍鱼体内GSH酶活性，实验期不投喂。
3.3组织匀浆的制备
将经药物胁迫后的刺参、鲍鱼先进行解冻，然后用剪刀剪碎，并用分析天平称取组织块0.2～1.0g左右，并加入其质量9倍的冷生理盐水，在玻璃匀浆管中充分研磨20次左右（6～8分钟），然后把制备好的组织匀浆用普通离心机4000转/分，离心l5 min，然后取上清液进行GSH酶活性的测定。
3.4酶活性测定
准备18支用纯水清洗干净的10mL比色管，每组4支（海参设置两组平行，鲍鱼不设平行组），另两只为照组。分别加入100uL已经离心好的浓度为1？g/L、5？g/L、10？g/L、20？g/L匀浆上清液，对照组加对应的对照组上清液，然后加入2mLTris缓冲溶液，100？LTCA摇匀后在25℃的恒温水浴锅中加热5分钟后加入100？L2.5mMDTNB混匀显色25分钟后，在415nm处测定其吸光度。
3.5酶活性计算公式
GSH含量=21.609*（A-A0）+0.066
4数据处理
数据用平均值±标准偏差表示。采用Excel、Sigmaplot12.5制作图表，用SPSS19.0软件进行数据分析。显著性差异检验采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验法，相关性分析采用皮尔逊（Pearson）方法，P<0.05 时被认为差异显著，P<0.01 时被认为差异极显著。
5实验结果和分析
5.1 蒽对刺参体内GSH酶活性的影响
在一定浓度蒽的胁迫作用下，GSH酶活性含量是个动态变化的过程 ，蒽浓度和时间是影响GSH酶活性的重要因素。
在剂量一效应关系面，刺参体内GSH酶活性的含量随着蒽浓度的增加而上升，但只有在2h和24h时有较为显著的线性关系。高浓度时蒽对GSH酶活性的诱导效应高于低浓度时的诱导效应。但是在有蒽胁迫的情况下，除了12h以外在其他时候GSH的含量均没有对照组高。在14d时解除暴露后再净化一个星期后GSH酶活性含量又达到了最高值。
5.2蒽对鲍鱼体内GSH酶活性的影响
GSH酶活性含量是个动态变化的过程，蒽浓度和时间是影响GSH酶活性的重要因素。
在时间一效应关系方面，海参体内GSH酶活性在4d内随着时间的延长出现了先升后降再升的趋势，并且在蒽浓度为20？g/L时这种趋势最为明显，而且呈现出很明显的“钟”型变化趋势，并且在12h值达到峰值，这说明表明鲍鱼体内GSH酶活性可在较短的时间内被诱导，而且是在蒽浓度为20？g/L诱导效果最为显著，且诱导效应在初期高于后期。但低浓度组（1、5？g/L）在不同时刻之间的变化不太明显。
6结论
6.1蒽对刺参体内GSH酶活性的影响
在蒽对刺参体内GSH酶活性的影响研究中我们发现，在12h时蒽对刺参体内GSH酶活性的诱导效应最强。而且随着污染物蒽浓度的增加GSH酶活性也增强，在21d时GSH含量恢复到了对照组的值，这说明净化实验能够使刺参体内GSH酶活性恢复到正常水平，这与穆景利，王新红[10]等人关于苯并（a）芘影响黑鲷肝脏EROD活性变化的动力学研究结果正好相同；另一方面也说明，暴露实验没有严重的超出刺参自身的抗氧化系统能力。
6.2蒽对鲍鱼体内GSH酶活性的影响
在蒽对鲍鱼体内GSH酶活性影响的研究中我们发现，随着污染物蒽浓度的递增GSH酶活性依次升高，但在第4d时GSH酶活性已经不随污染物浓度的变化而变化了，这说明此时污染物浓度已经不是影响GSH酶活性的关键因素了。此外我们还发现在污染物蒽浓度为20ug/L时，GSH酶活性出现了先升后降的趋势，并且在12h时GSH酶活性达到了最大值，这说明GSH酶活性可以很好地指示有机污染物对海参的生物响应，而且污染物蒽的响应浓度为20g/L。