【摘 要】
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为了提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的热稳定性,运用定向进化-易错PCR的方法,经两轮易错PCR引入突变,利用fast-blue RR顶层琼脂法对突变文库进行筛选,第
【机 构】
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江南大学工业生物技术教育部重点实验室; 江南大学药学院;
【基金项目】
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国家高科技研究发展计划(973计划)(No.2011CB710800);国家高技术研究发展计划(863计划)(Nos.2012AA022207,2011AA02A209,2011AA02A210);中央高校基本科研业务费专项资金(No.JUSRP11014);国家自然科学基金(No.20802027)资助~~
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为了提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的热稳定性,运用定向进化-易错PCR的方法,经两轮易错PCR引入突变,利用fast-blue RR顶层琼脂法对突变文库进行筛选,第一轮易错PCR后筛选到2株突变菌株,第二轮筛选到4株突变株。第二轮最佳突变株Ep2-4,其中3个氨基酸发生了突变:A129S、P168L和V329A。该突变酶ep2-4在60℃下半衰期相对原始酶r27RCL提高5.4倍,T50值提高7.8℃。酶学性质研究表明,突变酶ep2-4在热稳定性提高的基础上,仍保有良好的催化活性。蛋白质三维结构模拟显示,突变A129S可以和Gln133形成氢键,增加了酶表面的亲水性和极性;P168L可以与邻近的Leu164形成疏水键,导致突变酶的热稳定性提高。
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