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摘 要：目的：观察银翘散（YQS）对流感病毒感染胸腺缺陷小鼠细胞因子的影响。方法：以流感病毒亚洲甲型鼠肺适应株（FM1）感染小鼠为模型，采用银翘散灌胃治疗。用ELISA法分别检测感染后第1、3、5、7天小鼠血清中IFN-γ、IgG的含量。结果：银翘散各给药组IFN-γ的含量明显降低，与病毒感染模型组比较差异有显著性意义（P<0.01），银翘散各治疗组与感染模型组的IgG含量，差异不是十分显著（P>0.05）。结论：银翘散可以降低血清中IFN-γ，说明银翘散可以降低炎性因子的表达，从而减少炎性损伤。IgG含量与感染模型组差异不是十分显著，有可能因为在病毒感染早期，机体只能产生低水平低亲和力的抗体。
关键词：银翘散；流感病毒；细胞因子
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）02-0013-03
银翘散(YQS)由连翘、银花、苦桔梗、薄荷、竹叶、生甘草、芥穗、淡豆豉、牛蒡子9味中药组成，为治疗温病之首方，是辛凉清解的代表方剂，以其治疗风温、温热病以及某些杂病（属于邪在卫分、上焦）而闻名，并一直沿用至今。现代临床上用于治疗流行性感冒、急性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎、疱疹、麻疹、流行性腮腺炎等病毒性感染疾病［1］。本实验观察了该药对流感病毒感染胸腺缺陷小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、TGF-β1及IgG含量的影响，从分子水平探讨该药治疗病毒性呼吸道感染的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物及毒株
银翘解毒口服液：批号070301，河北华威制药有限公司。病毒唑：批号070609，天津药业集团新郑股份有限公司。病毒：流感病毒亚洲甲型鼠肺适应株（FM1），由中国中医科学院中药研究所提供，鸡胚传代后，血凝滴度为1:512，-70℃冻存备用。乙醚、生理盐水：由北京化学试剂公司提供。小鼠IFN-γ、TNF-αELISA试剂盒购自晶美生物工程（北京）有限公司，小鼠TGF-β1及IgG试剂盒购自Biotechnology Systems公司。
1.1.2 动物及分组
BALB/c nu/nu免疫缺陷裸小鼠，雌雄各半，共72只，体重18~20g，购自北京维通利华实验技术有限公司。按体重随机分组原则，将BALB/c nu/nu裸鼠分为正常对照组，模型组，病毒唑阳性药组，银翘散高、中、低剂量治疗组，各组按感染后1天、3天、5天、7天不同时相各分为4小组，每小组3只，分别标记，分笼饲养，所有动物自由摄食和饮水，控制温度湿度（18～25℃和55％±2%）。
1.1.3 仪器
微孔板扫描酶标仪(Bio-Tek公司)，微量加样器，CO2恒温培养箱，Labofuge 400R低温高速离心机(德国Heraeus公司)，DEM-Ⅲ型自动酶标洗板机（北京拓普分析仪器有限责任公司）。
1.2 方法
1.2.1 模型制备
以乙醚轻度麻醉小鼠后，BALB/c nu/nu裸鼠正常对照组以生理盐水30μL/只滴鼻，其余各组以FM1株病毒液30μL/只滴鼻。
1.2.3 实验给药
感染1小时后给药，给药体积为0.2mL/10g，病毒唑组每次腹腔注射0.07g/kg/d，银翘散高中低剂量组分别为40g/kg/d、20g/kg/d、10g/kg/d。正常空白组、感染模型组灌服生理盐水。
1.2.4 取材
分别于感染24、72、120、168h后，各组小鼠摘眼球取血，离心分离血清，放入-20℃冰箱中保存待测，脱颈椎处死小鼠，无菌取胸腺、脾脏、双侧后肢股骨骨髓，以备它用。
1.2.5 观察指标及方法
小鼠血清IFN-γ、IgG含量的测定。本实验采用双抗体夹心ELISA法，检测程序按照试剂盒说明书进行。
1.2.6 统计学处理
所有实验数据用±s表示，采用SPSS统计分析软件进行统计学处理。在进行显著性检验时，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 YQS对流感病毒FM1感染小鼠血清IFN-γ含量的影响
实验结果显示，流感病毒感染小鼠后，感染模型组各时相IFN-γ的含量较正常空白组均有所增加，且各时间点二者比较，差异显著（P<0.01）。其中第1、3天呈逐日上升趋势，第3天达峰值，第5天开始下降。银翘散各剂量组以及病毒唑组IFN-γ在各时间点的走势与感染模型组相同，但IFN-γ的含量较感染模型组均有所下降，差异显著（P<0.01）。说明银翘散可以抑制病毒感染后IFN-γ的表达。
各组比较见图1。
2.2 YQS对流感病毒FM1感染小鼠血清IgG含量的影响
实验结果显示，流感病毒感染后，病毒感染组与银翘散高、中、低剂量组各时间点的IgG的走势大致相同，呈逐渐上升趋势，但各组的IgG含量都很低。治疗组的IgG含量略低于感染模型组，差异不是十分显著（P>0.05）。有可能因为在病毒感染早期，机体只能产生低水平低亲和力的抗体，通常在感染后最初2周达高峰。
各组比较见图2。
3 讨论
流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，起病急骤，以全身中毒症状为主，亦可引起病毒性肺炎。流感病毒侵袭机体，病毒在宿主细胞内复制，并可入血，从而形成病毒血症。病毒作用于机体后，机体免疫细胞对于病毒可产生免疫应答，从而产生一些超过生理浓度的细胞因子。这些细胞因子释放入血后，其中具有致热作用的因子即可引起发热等全身中毒症状。研究发现，病理浓度的TNF-α、IL-1、IFN等都具有致热作用。IFN-γ的致热性作用方式可能是通过促进LPS而诱生IL-1。中医复方治疗病毒感染性疾病的优势并非单纯抗病毒本身，虽与促进机体免疫应答有关，却不能单纯用促进机体免疫应答来解释，其疗效机制可能与其抑制或调节机体炎症免疫病理反应有关。IFN-γ主要由活化的Th1和NK细胞产生，是机体抗病毒感染中最重要的细胞因子之一。它不仅可以阻止病毒在体内复制和扩散，而且能对许多免疫细胞发挥强大的免疫调节作用。有研究发现，IFN-γ及TNF-α可调节单核吞噬细胞产生超氧阴离子，如在短时间内大量产生TNF-α，IFN-γ将全身大量单核巨噬细胞激活，产生大量超氧阴离子导致组织器官的严重损伤［2］；同时，IFN-γ可促进T细胞和B细胞的分化，激活单核-巨噬细胞，促进炎性因子如TNF-α，IL-6，IL-1的产生，从而造成炎性损伤。因此内源性IFN-γ虽是维持机体抗感染所必不可少，但大量产生则又“走向问题的反面”。实验结果显示，感染模型组的IFN-γ含量与正常空白组比较，有所提高，二者比较，有显著性差异，银翘散组IFN-γ含量较之模型组有所减少，而且二者比较，亦有显著性差异。说明银翘散可以抑制病毒感染后IFN-γ的表达，降低炎性因子的表达，从而减少炎性损伤。。关于流感病毒感染小鼠后，血清中IFN-γ的表达，有些资料［3］显示IFN-γ升高，而有些资料［4］显示降低。究竟流感病毒感染对IFN-γ的产生是抑制还是促进，有待于进一步探讨。
病毒感染可诱导3种抗体：IgG、IgM、IgA。其中IgG是最重要的一类抗体，能直接中和体液中的病毒。尽管体液免疫在病毒感染后被激活，但在病毒感染早期，机体只能产生低水平低亲和力的抗体，通常在感染后最初2周达高峰，以后开始下降。本实验中各组的IgG含量都很低。治疗组的IgG含量略低于感染模型组，差异不是十分显著（P>0.05），有可能因为在感染初期，IgG水平比较低，也有可能因为本实验选用的老鼠是胸腺缺陷小鼠，有文献研究发现，T细胞及吞噬细胞功能障碍均可使自身完好的B细胞发生障碍而产生Ig或抗体缺乏症。
通过本实验，还可以发现，流感病毒所致机体的免疫状态是一个庞杂的细胞因子网络，各种细胞因子相互促进又相互制约，调节细胞因子生成的分子机制是复杂的，值得进一步探讨。
参考文献：
［1］ 吴幸周.银翘散现代临床运行的文献研究［D］.北京：北京中医药大学硕士研究生学位论文，2006:6-8.
［2］ 周炳荣.IFN-γ及TNF-α调节单核吞噬细胞超氧阴离子及在抗感染中的作用［J］.国外医学•免疫学分册，1994(2):65.
［3］ Robert NJ JL. The limited role of the human interferon systerm response to respiratory syneytial virus challenge， Analysis and comparison to influenza virus challenge［J］.Microb Pathog， 1992， 12:49.
［4］ 王飞，胥方元， 马萍，等. 感冒清口崩片对流感病毒FM1感染小鼠细胞因子水平的影响［J］. 中药药理与临床，2007，23(5):169-170.
（责任编辑：陈涌涛）
关键词：银翘散；流感病毒；细胞因子
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）02-0013-03
银翘散(YQS)由连翘、银花、苦桔梗、薄荷、竹叶、生甘草、芥穗、淡豆豉、牛蒡子9味中药组成，为治疗温病之首方，是辛凉清解的代表方剂，以其治疗风温、温热病以及某些杂病（属于邪在卫分、上焦）而闻名，并一直沿用至今。现代临床上用于治疗流行性感冒、急性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎、疱疹、麻疹、流行性腮腺炎等病毒性感染疾病［1］。本实验观察了该药对流感病毒感染胸腺缺陷小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、TGF-β1及IgG含量的影响，从分子水平探讨该药治疗病毒性呼吸道感染的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物及毒株
银翘解毒口服液：批号070301，河北华威制药有限公司。病毒唑：批号070609，天津药业集团新郑股份有限公司。病毒：流感病毒亚洲甲型鼠肺适应株（FM1），由中国中医科学院中药研究所提供，鸡胚传代后，血凝滴度为1:512，-70℃冻存备用。乙醚、生理盐水：由北京化学试剂公司提供。小鼠IFN-γ、TNF-αELISA试剂盒购自晶美生物工程（北京）有限公司，小鼠TGF-β1及IgG试剂盒购自Biotechnology Systems公司。
1.1.2 动物及分组
BALB/c nu/nu免疫缺陷裸小鼠，雌雄各半，共72只，体重18~20g，购自北京维通利华实验技术有限公司。按体重随机分组原则，将BALB/c nu/nu裸鼠分为正常对照组，模型组，病毒唑阳性药组，银翘散高、中、低剂量治疗组，各组按感染后1天、3天、5天、7天不同时相各分为4小组，每小组3只，分别标记，分笼饲养，所有动物自由摄食和饮水，控制温度湿度（18～25℃和55％±2%）。
1.1.3 仪器
微孔板扫描酶标仪(Bio-Tek公司)，微量加样器，CO2恒温培养箱，Labofuge 400R低温高速离心机(德国Heraeus公司)，DEM-Ⅲ型自动酶标洗板机（北京拓普分析仪器有限责任公司）。
1.2 方法
1.2.1 模型制备
以乙醚轻度麻醉小鼠后，BALB/c nu/nu裸鼠正常对照组以生理盐水30μL/只滴鼻，其余各组以FM1株病毒液30μL/只滴鼻。
1.2.3 实验给药
感染1小时后给药，给药体积为0.2mL/10g，病毒唑组每次腹腔注射0.07g/kg/d，银翘散高中低剂量组分别为40g/kg/d、20g/kg/d、10g/kg/d。正常空白组、感染模型组灌服生理盐水。
1.2.4 取材
分别于感染24、72、120、168h后，各组小鼠摘眼球取血，离心分离血清，放入-20℃冰箱中保存待测，脱颈椎处死小鼠，无菌取胸腺、脾脏、双侧后肢股骨骨髓，以备它用。
1.2.5 观察指标及方法
小鼠血清IFN-γ、IgG含量的测定。本实验采用双抗体夹心ELISA法，检测程序按照试剂盒说明书进行。
1.2.6 统计学处理
所有实验数据用±s表示，采用SPSS统计分析软件进行统计学处理。在进行显著性检验时，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 YQS对流感病毒FM1感染小鼠血清IFN-γ含量的影响
实验结果显示，流感病毒感染小鼠后，感染模型组各时相IFN-γ的含量较正常空白组均有所增加，且各时间点二者比较，差异显著（P<0.01）。其中第1、3天呈逐日上升趋势，第3天达峰值，第5天开始下降。银翘散各剂量组以及病毒唑组IFN-γ在各时间点的走势与感染模型组相同，但IFN-γ的含量较感染模型组均有所下降，差异显著（P<0.01）。说明银翘散可以抑制病毒感染后IFN-γ的表达。
各组比较见图1。
2.2 YQS对流感病毒FM1感染小鼠血清IgG含量的影响
实验结果显示，流感病毒感染后，病毒感染组与银翘散高、中、低剂量组各时间点的IgG的走势大致相同，呈逐渐上升趋势，但各组的IgG含量都很低。治疗组的IgG含量略低于感染模型组，差异不是十分显著（P>0.05）。有可能因为在病毒感染早期，机体只能产生低水平低亲和力的抗体，通常在感染后最初2周达高峰。
各组比较见图2。
3 讨论
流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，起病急骤，以全身中毒症状为主，亦可引起病毒性肺炎。流感病毒侵袭机体，病毒在宿主细胞内复制，并可入血，从而形成病毒血症。病毒作用于机体后，机体免疫细胞对于病毒可产生免疫应答，从而产生一些超过生理浓度的细胞因子。这些细胞因子释放入血后，其中具有致热作用的因子即可引起发热等全身中毒症状。研究发现，病理浓度的TNF-α、IL-1、IFN等都具有致热作用。IFN-γ的致热性作用方式可能是通过促进LPS而诱生IL-1。中医复方治疗病毒感染性疾病的优势并非单纯抗病毒本身，虽与促进机体免疫应答有关，却不能单纯用促进机体免疫应答来解释，其疗效机制可能与其抑制或调节机体炎症免疫病理反应有关。IFN-γ主要由活化的Th1和NK细胞产生，是机体抗病毒感染中最重要的细胞因子之一。它不仅可以阻止病毒在体内复制和扩散，而且能对许多免疫细胞发挥强大的免疫调节作用。有研究发现，IFN-γ及TNF-α可调节单核吞噬细胞产生超氧阴离子，如在短时间内大量产生TNF-α，IFN-γ将全身大量单核巨噬细胞激活，产生大量超氧阴离子导致组织器官的严重损伤［2］；同时，IFN-γ可促进T细胞和B细胞的分化，激活单核-巨噬细胞，促进炎性因子如TNF-α，IL-6，IL-1的产生，从而造成炎性损伤。因此内源性IFN-γ虽是维持机体抗感染所必不可少，但大量产生则又“走向问题的反面”。实验结果显示，感染模型组的IFN-γ含量与正常空白组比较，有所提高，二者比较，有显著性差异，银翘散组IFN-γ含量较之模型组有所减少，而且二者比较，亦有显著性差异。说明银翘散可以抑制病毒感染后IFN-γ的表达，降低炎性因子的表达，从而减少炎性损伤。。关于流感病毒感染小鼠后，血清中IFN-γ的表达，有些资料［3］显示IFN-γ升高，而有些资料［4］显示降低。究竟流感病毒感染对IFN-γ的产生是抑制还是促进，有待于进一步探讨。
病毒感染可诱导3种抗体：IgG、IgM、IgA。其中IgG是最重要的一类抗体，能直接中和体液中的病毒。尽管体液免疫在病毒感染后被激活，但在病毒感染早期，机体只能产生低水平低亲和力的抗体，通常在感染后最初2周达高峰，以后开始下降。本实验中各组的IgG含量都很低。治疗组的IgG含量略低于感染模型组，差异不是十分显著（P>0.05），有可能因为在感染初期，IgG水平比较低，也有可能因为本实验选用的老鼠是胸腺缺陷小鼠，有文献研究发现，T细胞及吞噬细胞功能障碍均可使自身完好的B细胞发生障碍而产生Ig或抗体缺乏症。
通过本实验，还可以发现，流感病毒所致机体的免疫状态是一个庞杂的细胞因子网络，各种细胞因子相互促进又相互制约，调节细胞因子生成的分子机制是复杂的，值得进一步探讨。
参考文献：
［1］ 吴幸周.银翘散现代临床运行的文献研究［D］.北京：北京中医药大学硕士研究生学位论文，2006:6-8.
［2］ 周炳荣.IFN-γ及TNF-α调节单核吞噬细胞超氧阴离子及在抗感染中的作用［J］.国外医学•免疫学分册，1994(2):65.
［3］ Robert NJ JL. The limited role of the human interferon systerm response to respiratory syneytial virus challenge， Analysis and comparison to influenza virus challenge［J］.Microb Pathog， 1992， 12:49.
［4］ 王飞，胥方元， 马萍，等. 感冒清口崩片对流感病毒FM1感染小鼠细胞因子水平的影响［J］. 中药药理与临床，2007，23(5):169-170.
（责任编辑：陈涌涛）