【摘 要】
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[目的]探究miR-145a-3p对布鲁氏菌诱导的巨噬细胞(RAW264.7)自噬及其对布鲁氏菌胞内生存的影响.[方法]首先合成自噬相关miRNA miR-145a-3p的模拟物(miR-145a-3p mimics)和抑制剂(miR-145a-3p inhibitor)及对照模拟物(NC mimics),转染至GFP-RFP-RAW264.7细胞中,然后用布鲁氏菌侵染该细胞24 h,通过激光共聚焦显微镜观察miR-145a-3p对自噬的影响;运用TargetScan、miRBase等生物信息学软件预测m
【机 构】
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石河子大学动物科技学院,石河子832000;人兽共患传染性疾病防治协同创新中心,石河子832000;新疆职业大学,乌鲁木齐830013
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[目的]探究miR-145a-3p对布鲁氏菌诱导的巨噬细胞(RAW264.7)自噬及其对布鲁氏菌胞内生存的影响.[方法]首先合成自噬相关miRNA miR-145a-3p的模拟物(miR-145a-3p mimics)和抑制剂(miR-145a-3p inhibitor)及对照模拟物(NC mimics),转染至GFP-RFP-RAW264.7细胞中,然后用布鲁氏菌侵染该细胞24 h,通过激光共聚焦显微镜观察miR-145a-3p对自噬的影响;运用TargetScan、miRBase等生物信息学软件预测miR-145a-3p的靶蛋白;通过构建PmirGLO-ATG14-3\'UTR和PmirGLO-ATG14-3\'UTR-mutation重组质粒,用Sac Ⅰ和Kpn Ⅰ进行双酶切鉴定,并利用双荧光素酶报告系统验证miR-145a-3p与自噬相关基因(autophagy-related gene 14,ATG14)的靶向关系;将RAW264.7细胞培养至60％汇合时,分别转染miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics,转染7h后用布鲁氏菌侵染,添加PBS作为未感染对照,培养24h收集细胞,利用实时荧光定量PCR、Western blotting检测miR-145a-3p对ATG14 mRNA和蛋白表达的调控作用;最后通过布鲁氏菌侵染已转染miR-145a-3p的巨噬细胞,进行菌落计数,验证miR-145a-3p对布鲁氏菌胞内生存的影响.[结果]miR-145a-3p mimics促进布鲁氏菌诱导的细胞自噬,miR-145a-3p inhibitor抑制布鲁氏菌诱导的细胞自噬;软件预测结果表明,miR-145a-3p靶基因为自噬相关蛋白ATG14-3\'UTR;双酶切结果显示,重组质粒PmirGLO-ATG14-3\'UTR和PmirGLO-ATG14-3\'UTR-mutation构建成功;双荧光素酶报告基因系统验证miR-145a-3p mimics与ATG14-3\'UTR互相作用时,与NC mimics组相比,miR-145a-3p mimics组荧光值极显著降低(P＜0.01).与NC mimics组相比,未感染布鲁氏菌时,miR-145a-3p mimics组ATG14 mRNA水平极显著降低(P＜0.01)、ATG14蛋白的表达水平显著降低(P＜0.05),miR-145a-3p inhibitor组ATG14 mRNA水平极显著上调(P＜0.01);布鲁氏菌感染后,miR-145a-3pmimics+Bru组ATG14 mRNA水平极显著提高(P＜0.01),且miR-145a-3pmimics+Bru组ATG14 mRNA的水平显著高于NC mimics+ Bru组(P＜0.05).miR-145a-3p mimics促进ATG14蛋白的表达水平.miR-145a-3p的过表达导致布鲁氏菌的胞内生存数量显著降低(P＜0.05).[结论]miR-145a-3p在布鲁氏菌感染细胞后高表达,miR-145a-3p通过靶向ATG14促进自噬,抑制布鲁氏菌复制.
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