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摘 要 WRKY家族为植物所特有，参与调控植物逆境胁迫、生长发育和衰老等生物学过程。为了获得WRKY70同源基因在桉树响应胁迫中的作用和功能，克隆巨桉（Eucalyptus grandis）中的EgrWRKY70基因，通过生物信息学分析和qRT-PCR进行功能的初步鉴定。结果表明，EgrWRKY70基因编码321个氨基酸，蛋白分子量为36.18 ku，只有一个WRKY结构域，属于WRKY转录因子III a类成员。同时，EgrWRKY70与麻风树的JcuWRKY70的亲缘关系最近，其氨基酸序列相似性达到58.2%。半定量RT-PCR分析表明，EgrWRKY70主要在巨桉叶片、根和花中表达，而在茎部表达量较低。实时定量qRT-PCR分析显示：EgrWRKY70基因在低温和盐胁迫下，表达量快速升高然后下降；在盐胁迫下EgrWRKY70基因表达仍然维持在较高水平；在油菜素内酯和水杨酸处理时，EgrWRKY70基因能够快速的响应，使用茉莉酸甲酯处理时其表达量没有发生明显的变化。由此表明，EgrWRKY70能够通过不同的响应方式参与桉树生物和非生物胁迫的应答。
关键词 巨桉；EgrWRKY70；基因克隆；差异表达
中图分类号 S792.39 文献标识码 A
Abstract The plant-specific WRKY transcription factor family appears to be involved in the regulation of various biological processes including response to stresses， growth and development， and senescence. In order to identify the function response to stress of WRKY70 in Eucalyptus grandis， EgrWRKY70 was cloned and analyzed by using reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）and real time quantitative PCR（qRT-PCR）. EgrWRKY70 encoded a predict protein of 321 amino acids. The theoretical molecular weight of EgrWRKY70 was 36.18 ku with pI of 5.28， unstability index of 63.67. EgrWRKY70 contained a conserved WRKY domain and belonged to group IIIa. The results of multiple alignments and phylogenetic analysis revealed that EgrWRKY70 closed to JcuWRKY70 with 58.2% similarity. The expression of EgrWRKY70 was detected in flowers， leaves and roots by semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction， and EgrWRKY70 did not nearly expressed in stem including xylem and phloem. Expression of EgrWRKY70 increased firstly and then decreased with the duration of the treatment of salt and cold. However， the EgrWRKY70 expression maintained at a high level under salt stress. Besides， after the treatments of salicylic acid and brassinolide， the levels of EgrWRKY70 expression increased rapidly and then decreased. The expression of EgrWRKY70 almost did not changed after the treatment of methyl jasmonate. These results suggested that EgrWRKY70 may have relationship with biotic and abiotic stress responses in E. grandis.
Key words Eucalyptus grandis， EgrWRKY70； Gene cloning； Gene expression
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.016
WRKY家族是植物所特有的转录因子，含有一段由60个氨基酸组成的高度保守的WRKY结构域，N端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸残基，C端具有锌指结构，其结构域可以与具有（T）TGAC（C/T）序列的W-box顺式作用元件的靶基因特异结合，从而调控下游基因的表达。WRKY家族成员众多，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中存在74个WRKY家族基因，水稻（Oryza sativa）中预测发现100多个WRKY成员[1-3]。近来，采用分子生物学和正向遗传学突变体筛选等方法鉴定出WRKY家族成员的基因功能，发现其参与到调控植物生长发育[4-5]、衰老[6]、代谢调控[7]等生物学过程，除此之外WRKY家族基因在防御生物和非生物胁迫[8-10]及其过程中的信号转导[11]中均起到重要作用。其中WRKY70可以与其结构类似的WRKY46、WRKY53协同和激素水杨酸（Salicylic acid，SA）、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）相互作用，在假单胞杆菌和黑斑病菌（Alternaria brassicicola）的抗性中起到正调控作用[12-14]。而其在木本植物中对于这些病菌的感染作用是否具有相同的调控作用尚未进行研究。 桉树（Eucalyptus）是桃金娘科（Myrtaceae）桉树属（Eucalyptus）的总称，具有速生丰产、适应性广等特点，在热带和亚热带地区栽培广泛，已成为华南地区第一大造林树种。但随着种植面积的扩大，桉树病害发生面积和分布范围也有扩大的趋势， 其中焦枯病（Cylindrocladium quinqueseptatum）和青枯病（Pseudomonas solanacearum）的发病率最高，造成重大的经济损失。若能从桉树中克隆一些抗逆转录因子基因导入到桉树栽培品种中，获得抗性较强的桉树新品种，将为解决桉树的病虫害提供一种新模式，因此，相关基因的筛选和功能鉴定变得尤为重要。而在模式植物拟南芥中证实WRKY70在响应逆境胁迫中起到重要的作用，但在木本植物中尚未见相关报道。为了鉴定桉树中的WRKY70同源基因是否具有相同或相似的耐胁迫功能，本研究以巨桉（Eucalyptus grandis）为材料进行了WRKY70同源基因的克隆，同时使用实时定量PCR技术对其在低温、高盐逆境胁迫和油菜素内酯（Brassinolide，BR）、MeJA、SA处理下的时空表达模式进行了初步分析，为下一步的功能鉴定奠定基础，以期为桉树抗逆分子育种提供候选基因和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料及处理 组织表达分析所用材料为巨桉无性系GL1，花和3年生木质部和韧皮部+形成层，材料取自广东肇庆市四会贞山苗圃3年生桉树GL1，其中木质部和韧皮部+形成层部位取1.5 m处。桉树GL1材料为组培苗转移到温室6个月，苗高为1 m左右，取木质部、韧皮部+形成层、幼嫩叶片、成熟叶片、根器官。基因克隆材料以花器官提取的cDNA为模板。
对于不同处理的样品，以巨桉无性系GL1为材料，30～40 cm高，生长状况良好植株。分别采用0.2 μmol/L BR、0.1 mmol/L MeJA、0.1 mmol/L SA喷施处理，分别在0，1，6，24，168 h后取叶片。盐处理采用200 mmol/L NaCl灌根处理，分别在0，1，6，24，168 h取叶片。冷处理采用在4 ℃条件下2，4，24，48 h，具体处理参见魏晓玲等方法[15]。每个处理5株，每个处理3个重复。统一采取顶端向下4～6片叶片，立即放于液氮中速冻，用于RNA提取。
1.1.2 试剂和引物 大肠杆菌（Escherichia coli） Trans1-T1（DH5α）感受态，pBlunt simple-T1 Cloning Kit 购自北京全式金生物技术有限公司；Q5 High-Fidelity PCR Kit，Quick-Load Taq 2X Master Mix购自NEB；QIAquick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒、Plasmid Mini Prep质粒提取试剂盒、DNase I试剂盒购自QIAGEN。引物合成由上海英俊合成（表1），DNA测序由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取及cDNA第一链合成 采取约0.1 g的桉树材料放在冻存管中，快速放入液氮中冻存。采用艾德莱德植物RNA提取试剂盒说明书进行总RNA提取，然后经过DNase I消化基因组DNA，得到纯化的总RNA。经过NanoDrop-2000检测质量和浓度。取1 μg检测合格的总RNA，采用Invitrogen公司的SuperscriptIII反转录试剂盒进行cDNA合成。
1.2.2 基因克隆和测序 基于桉树基因组测序的结果，以模式植物拟南芥的WRKY70，进行比对分析，筛选出与之同源巨桉WRKY70。该基因序列长度为1 372 bp，包含完整ORF编码框（966 bp），以此序列设计引物用于EgrWRKY70基因的全长cDNA 扩增。由于在半定量分析时发现EgrWRKY70在花组织中表达量较高，因此以巨桉花组织总RNA的反转录cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增完成后用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收目的片段条带，连接克隆载体pEASY blunt-T1，并转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，过夜生长。挑取单菌进行克隆，摇菌，并进行菌液PCR检测，确认条带大小无误后取菌液送上海生物工程技术服务有限公司进行测序。
1.2.3 生物信息学分析及进化树构建 利用Expasy 数据库中的在线分析软件ProtParam（http：//expasy.org/tools/protparam.html）分析并预测巨桉WRKY70蛋白的理化性质，包括该蛋白的氨基酸成分，相对分子量，是否能稳定存在等。用SOPMA程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_
sopma.pl）进行二级结构预测。用swiss-model分析软件（http：//swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html）进行三维空间结构预测。蛋白质无序化分析软件为FoldIndex（http：//bioportal.weizmann.ac.il/fldbin/findex）[16]。蛋白质跨膜区预测软件为TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）。蛋白质模体分析软件为MEME（Multiple EM for Motif Elicitation，MEME，http：//meme.sdsc.edu/）。蛋白质结构域分析使用在线软件SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）ko3.1，使用在线软件TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）对蛋白质进行亚细胞定位[17]。通过NCBI的BLASTX（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）查找不同植物的同源序列，对不同植物的WRKY70蛋白序列与巨桉WRKY70蛋白序列进行多序列比对，采用Javaview中的ClustalW Multiple Sequence Alignment程序。进化树采用Gblock多重比对下的平均距离树（Average Distance Tree）来表示。 1.2.4 基因差异表达分析 利用半定量PCR分析EgrWRKY70基因在不同组织中的表达情况，选择EgrACT在不同组织中为参照基因[18]。利用Primer 5.0设计EgrWRKY70基因的半定量引物。半定量PCR反应分别以3年生桉树木质部、1年生桉树茎、花、3年生桉树韧皮部、1年生桉树木质部、幼叶、成熟叶、根组织的cDNA为模板，反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35个循环。将PCR产物与染液（MAESTROGEN，USA）按照10 ∶ 1比例混合后于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
对于不同处理的EgrWRKY70基因表达分析，利用ABI7500荧光定量分析仪，采用SYBR Premix ExTaq II（Takara）试剂进行分析。cDNA样品稀释20倍，程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。溶解曲线程序为：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。使用EgrACT为参照基因，所有试验为3个生物学重复，每个重复至少3个定量重复分析。
2 结果与分析
2.1 EgrWRKY70基因的克隆及其在不同组织中的表达分析
通过电子克隆（Eucgr.G03145）和RT-PCR方法，从巨桉GL1花器官中克隆到EgrWRKY70基因。测序结果表明，其核苷酸序列与电子克隆序列一致，经过BLAST比对，该序列编码的氨基酸中含有一个典型的WRKY结构域，位于131-193氨基酸之间，属于WRKY家族1类，将该基因命名为EgrWRKY70。其ORF长度为966 bp，编码321个氨基酸序列。采用生物信息学分析得到其分子量为36.18 ku，理论等电点为5.28，不稳定系数为63.67，说明这个蛋白是不稳定的；脂溶性系数为54.08，表现为脂溶性蛋白；总亲水性系数为-0.862，为亲水性蛋白。蛋白质二级结构分析表明，无规则卷曲是该蛋白的主要组成元件，占所有结构的71.65%，另外α-螺旋占蛋白结构的17.13%，β-折叠为11.21%。亚细胞定位预测表明其定位在细胞核。信号肽序列分析表明其没有信号肽存在。蛋白无序性分析表明，其蛋白无性系为-0.050，存在4个无序区，分别为1～38、79～234、255～281、290～321，最长无序区长度为165个氨基酸（图1-A）。
通过半定量PCR分析其在不同组织中的表达发现，EgrWRKY70主要在叶（包括嫩叶和成熟叶）、花和根中表达（图1-B），因此在后面的实验中选择叶片进行RNA提取和定量表达分析。除此之外，在3年生韧皮部有少量表达，而在3年生木质部和1年生茎部（包括木质部、韧皮部和皮层）没有或几乎看不到表达。说明EgrWRKY70表达具有组织特异性。
2.2 多重比较和进化树分析
通过与其他物种WRKY家族蛋白进行多重序列比对分析表明，所有植物中的WRKY70家族都只有一个保守的氨基酸WRKY序列，属于WRKY转录因子III a类成员。利用NCBI中的Blast程序对EgrWRKY70编码蛋白与其它植物中WRKY70蛋白进行同源性分析（图2），结果表明蛋白EgrWRKY70与拟南芥、大豆、杨树、麻疯树、可可等WRKY70蛋白同源性为39%～58%，同时这些蛋白都具有5个明显的保守结构域。将不同植物的WRKY70蛋白聚类分析表明，桉树与麻风树（Jatroph acurcas）亲缘关系最近，与毛果杨（Populus trichocarpa）、蓖麻（Ricinus communis）、可可（Theobron macacao）、棉花（Gossypium raimondii）、桃树（Prunus persicappa）中的WRKY70具有较近的亲源关系，聚类在一起，而作为草本植物的拟南芥与其他木本植物的WRKY70亲缘关系较远（图3）。进一步利用网站Expasy中Swiss Model程序同源建模，推测该蛋白的三维结构模型如图4所示。其结构与拟南芥的WRKY70蛋白类似，可以推知EgrWRKY70蛋白与拟南芥WRKY70蛋白有相似的生物学功能。
2.3 基因对不同处理的响应
从图5可以看到，在BR、SA、MeJA处理后，EgrWRKY70基因通过表达量明显提高快速响应外源激素的变化，其中SA处理1 h时，EgrWRKY70基因表达量约是对照的21.81倍，而BR和MeJA处理6 h时，EgrWRKY70基因的转录水平分别为对照的10.55和3.03倍（图5-A、B、C）。而在经过24 h或168 h后，EgrWRKY70基因的表达量恢复到正常水平。表明EgrWRKY70能够快速响应BR、SA、MeJA外源激素的处理。
尽管如此，EgrWRKY70应对非生物胁迫时呈现出不同的调控方式。本研究中，在盐处理1 h时，EgrWRKY70能够对盐胁迫做出快速的反应，其表达量达到对照的14.35倍（图5-D）。除此之外，随着时间延长，EgrWRKY70基因表达量略微降低，但与对照相比，其表达量仍然维持在一个较高的水平。同时在长期处理（168 h）时EgrWRKY70基因的表达量达到对照的28.26倍。说明EgrWRKY70在短期和长期盐胁迫响应表达量一直维持着较高的水平来调控巨桉应对盐胁迫。在冷处理响应中EgrWRKY70则表现出快速响应，在2 h和4 h达到对照表达量的7.08和3.40倍，然后表达量恢复到正常水平（图5-E）。这些都说明EgrWRKY70在对于不同的逆境胁迫存在着不同的响应方式，这些不同的响应方式也意味着桉树在不同的逆境条件下EgrWRKY70的调控途径以及调控机制存在着差异。
3 讨论与结论
在早期的研究中已发现水杨酸、油菜素内酯、茉莉酸甲酯等生长调节剂在应对生物胁迫及非生物胁迫反应的重要信号分子，能诱导多种植物对生物和非生物胁迫产生持续抗性，减缓植物对包括病原菌侵染等多种逆境胁迫的伤害[19-22]。WRKY70是WRKY转录因子III a类成员，在生物胁迫过程中参与到植物防御过程，WRKY70突变体植株表现出对白粉菌（Erysiphe cichoracearum）和霜霉病菌（Hyaloperonospora parasitica）更加敏感，而值得注意的是更加耐黑斑病菌（Alternaria brassicicola）[14]。与之相反，过表达WRKY70基因会提高植物对黑斑病菌（Alternaria brassicicola）的抗性，但会降低植物对白粉菌的抗性[14]。在此过程中会引起几个JA响应基因的抑制，而部分通过NPR1来执行，表明WRKY70在调控依赖SA和JA防御途径中的平衡作用中起到重要作用[8，14]。除此之外，AtWRKY70作用于防御相关的活性氧中间物和SA下游，作为基本防御机制的主要成员，被RPP4或RPP7引发，参与到RPP4调控的防御[12]。而突变体wrky46wrky70和wrky46wrky70wrky53表现出对病菌的敏感性增加，病害表型更加明显。说明WRKY70与其结构相似且功能冗余的同源基因WRKY46、WRKY53共同调控对丁香假单胞杆菌的基础防御[13]。在本研究中通过外施水杨酸、油菜素内酯、茉莉酸甲酯到桉树叶片发现EgrWRKY70呈现出不同的表达变化，其中外施水杨酸和油菜素内酯时EgrWRKY70的表达量快速升高，尤其是在外施水杨酸时EgrWRKY70基因在1 h后的表达量大幅度增加。而在前期的研究中未发现通过外施水杨酸能够诱导桉树对青枯菌的抗性[23-24]，这也预示着EgrWRKY70可能会在诱导桉树青枯病抗性中起到正调控作用。值得注意的是在茉莉酸甲酯外施处理时，EgrWRKY70表达量变化较小甚至没有变化，这可能是与拟南芥中WRKY70的作用方式不同。同时，在本研究中还发现其在盐胁迫和冷胁迫中能过快速的响应和表达，尤其在盐胁迫时能够持续的表达，说明EgrWRKY70可能在非生物胁迫中也起到重要的调控作用。这与拟南芥中报道的WRKY70和WRKY54响应渗透压胁迫时响应类似[25]，可能是WRKY70主要响应盐胁迫中的渗透压胁迫。
关键词 巨桉；EgrWRKY70；基因克隆；差异表达
中图分类号 S792.39 文献标识码 A
Abstract The plant-specific WRKY transcription factor family appears to be involved in the regulation of various biological processes including response to stresses， growth and development， and senescence. In order to identify the function response to stress of WRKY70 in Eucalyptus grandis， EgrWRKY70 was cloned and analyzed by using reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）and real time quantitative PCR（qRT-PCR）. EgrWRKY70 encoded a predict protein of 321 amino acids. The theoretical molecular weight of EgrWRKY70 was 36.18 ku with pI of 5.28， unstability index of 63.67. EgrWRKY70 contained a conserved WRKY domain and belonged to group IIIa. The results of multiple alignments and phylogenetic analysis revealed that EgrWRKY70 closed to JcuWRKY70 with 58.2% similarity. The expression of EgrWRKY70 was detected in flowers， leaves and roots by semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction， and EgrWRKY70 did not nearly expressed in stem including xylem and phloem. Expression of EgrWRKY70 increased firstly and then decreased with the duration of the treatment of salt and cold. However， the EgrWRKY70 expression maintained at a high level under salt stress. Besides， after the treatments of salicylic acid and brassinolide， the levels of EgrWRKY70 expression increased rapidly and then decreased. The expression of EgrWRKY70 almost did not changed after the treatment of methyl jasmonate. These results suggested that EgrWRKY70 may have relationship with biotic and abiotic stress responses in E. grandis.
Key words Eucalyptus grandis， EgrWRKY70； Gene cloning； Gene expression
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.016
WRKY家族是植物所特有的转录因子，含有一段由60个氨基酸组成的高度保守的WRKY结构域，N端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸残基，C端具有锌指结构，其结构域可以与具有（T）TGAC（C/T）序列的W-box顺式作用元件的靶基因特异结合，从而调控下游基因的表达。WRKY家族成员众多，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中存在74个WRKY家族基因，水稻（Oryza sativa）中预测发现100多个WRKY成员[1-3]。近来，采用分子生物学和正向遗传学突变体筛选等方法鉴定出WRKY家族成员的基因功能，发现其参与到调控植物生长发育[4-5]、衰老[6]、代谢调控[7]等生物学过程，除此之外WRKY家族基因在防御生物和非生物胁迫[8-10]及其过程中的信号转导[11]中均起到重要作用。其中WRKY70可以与其结构类似的WRKY46、WRKY53协同和激素水杨酸（Salicylic acid，SA）、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）相互作用，在假单胞杆菌和黑斑病菌（Alternaria brassicicola）的抗性中起到正调控作用[12-14]。而其在木本植物中对于这些病菌的感染作用是否具有相同的调控作用尚未进行研究。 桉树（Eucalyptus）是桃金娘科（Myrtaceae）桉树属（Eucalyptus）的总称，具有速生丰产、适应性广等特点，在热带和亚热带地区栽培广泛，已成为华南地区第一大造林树种。但随着种植面积的扩大，桉树病害发生面积和分布范围也有扩大的趋势， 其中焦枯病（Cylindrocladium quinqueseptatum）和青枯病（Pseudomonas solanacearum）的发病率最高，造成重大的经济损失。若能从桉树中克隆一些抗逆转录因子基因导入到桉树栽培品种中，获得抗性较强的桉树新品种，将为解决桉树的病虫害提供一种新模式，因此，相关基因的筛选和功能鉴定变得尤为重要。而在模式植物拟南芥中证实WRKY70在响应逆境胁迫中起到重要的作用，但在木本植物中尚未见相关报道。为了鉴定桉树中的WRKY70同源基因是否具有相同或相似的耐胁迫功能，本研究以巨桉（Eucalyptus grandis）为材料进行了WRKY70同源基因的克隆，同时使用实时定量PCR技术对其在低温、高盐逆境胁迫和油菜素内酯（Brassinolide，BR）、MeJA、SA处理下的时空表达模式进行了初步分析，为下一步的功能鉴定奠定基础，以期为桉树抗逆分子育种提供候选基因和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料及处理 组织表达分析所用材料为巨桉无性系GL1，花和3年生木质部和韧皮部+形成层，材料取自广东肇庆市四会贞山苗圃3年生桉树GL1，其中木质部和韧皮部+形成层部位取1.5 m处。桉树GL1材料为组培苗转移到温室6个月，苗高为1 m左右，取木质部、韧皮部+形成层、幼嫩叶片、成熟叶片、根器官。基因克隆材料以花器官提取的cDNA为模板。
对于不同处理的样品，以巨桉无性系GL1为材料，30～40 cm高，生长状况良好植株。分别采用0.2 μmol/L BR、0.1 mmol/L MeJA、0.1 mmol/L SA喷施处理，分别在0，1，6，24，168 h后取叶片。盐处理采用200 mmol/L NaCl灌根处理，分别在0，1，6，24，168 h取叶片。冷处理采用在4 ℃条件下2，4，24，48 h，具体处理参见魏晓玲等方法[15]。每个处理5株，每个处理3个重复。统一采取顶端向下4～6片叶片，立即放于液氮中速冻，用于RNA提取。
1.1.2 试剂和引物 大肠杆菌（Escherichia coli） Trans1-T1（DH5α）感受态，pBlunt simple-T1 Cloning Kit 购自北京全式金生物技术有限公司；Q5 High-Fidelity PCR Kit，Quick-Load Taq 2X Master Mix购自NEB；QIAquick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒、Plasmid Mini Prep质粒提取试剂盒、DNase I试剂盒购自QIAGEN。引物合成由上海英俊合成（表1），DNA测序由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取及cDNA第一链合成 采取约0.1 g的桉树材料放在冻存管中，快速放入液氮中冻存。采用艾德莱德植物RNA提取试剂盒说明书进行总RNA提取，然后经过DNase I消化基因组DNA，得到纯化的总RNA。经过NanoDrop-2000检测质量和浓度。取1 μg检测合格的总RNA，采用Invitrogen公司的SuperscriptIII反转录试剂盒进行cDNA合成。
1.2.2 基因克隆和测序 基于桉树基因组测序的结果，以模式植物拟南芥的WRKY70，进行比对分析，筛选出与之同源巨桉WRKY70。该基因序列长度为1 372 bp，包含完整ORF编码框（966 bp），以此序列设计引物用于EgrWRKY70基因的全长cDNA 扩增。由于在半定量分析时发现EgrWRKY70在花组织中表达量较高，因此以巨桉花组织总RNA的反转录cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增完成后用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收目的片段条带，连接克隆载体pEASY blunt-T1，并转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，过夜生长。挑取单菌进行克隆，摇菌，并进行菌液PCR检测，确认条带大小无误后取菌液送上海生物工程技术服务有限公司进行测序。
1.2.3 生物信息学分析及进化树构建 利用Expasy 数据库中的在线分析软件ProtParam（http：//expasy.org/tools/protparam.html）分析并预测巨桉WRKY70蛋白的理化性质，包括该蛋白的氨基酸成分，相对分子量，是否能稳定存在等。用SOPMA程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_
sopma.pl）进行二级结构预测。用swiss-model分析软件（http：//swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html）进行三维空间结构预测。蛋白质无序化分析软件为FoldIndex（http：//bioportal.weizmann.ac.il/fldbin/findex）[16]。蛋白质跨膜区预测软件为TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）。蛋白质模体分析软件为MEME（Multiple EM for Motif Elicitation，MEME，http：//meme.sdsc.edu/）。蛋白质结构域分析使用在线软件SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）ko3.1，使用在线软件TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）对蛋白质进行亚细胞定位[17]。通过NCBI的BLASTX（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）查找不同植物的同源序列，对不同植物的WRKY70蛋白序列与巨桉WRKY70蛋白序列进行多序列比对，采用Javaview中的ClustalW Multiple Sequence Alignment程序。进化树采用Gblock多重比对下的平均距离树（Average Distance Tree）来表示。 1.2.4 基因差异表达分析 利用半定量PCR分析EgrWRKY70基因在不同组织中的表达情况，选择EgrACT在不同组织中为参照基因[18]。利用Primer 5.0设计EgrWRKY70基因的半定量引物。半定量PCR反应分别以3年生桉树木质部、1年生桉树茎、花、3年生桉树韧皮部、1年生桉树木质部、幼叶、成熟叶、根组织的cDNA为模板，反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35个循环。将PCR产物与染液（MAESTROGEN，USA）按照10 ∶ 1比例混合后于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
对于不同处理的EgrWRKY70基因表达分析，利用ABI7500荧光定量分析仪，采用SYBR Premix ExTaq II（Takara）试剂进行分析。cDNA样品稀释20倍，程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。溶解曲线程序为：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。使用EgrACT为参照基因，所有试验为3个生物学重复，每个重复至少3个定量重复分析。
2 结果与分析
2.1 EgrWRKY70基因的克隆及其在不同组织中的表达分析
通过电子克隆（Eucgr.G03145）和RT-PCR方法，从巨桉GL1花器官中克隆到EgrWRKY70基因。测序结果表明，其核苷酸序列与电子克隆序列一致，经过BLAST比对，该序列编码的氨基酸中含有一个典型的WRKY结构域，位于131-193氨基酸之间，属于WRKY家族1类，将该基因命名为EgrWRKY70。其ORF长度为966 bp，编码321个氨基酸序列。采用生物信息学分析得到其分子量为36.18 ku，理论等电点为5.28，不稳定系数为63.67，说明这个蛋白是不稳定的；脂溶性系数为54.08，表现为脂溶性蛋白；总亲水性系数为-0.862，为亲水性蛋白。蛋白质二级结构分析表明，无规则卷曲是该蛋白的主要组成元件，占所有结构的71.65%，另外α-螺旋占蛋白结构的17.13%，β-折叠为11.21%。亚细胞定位预测表明其定位在细胞核。信号肽序列分析表明其没有信号肽存在。蛋白无序性分析表明，其蛋白无性系为-0.050，存在4个无序区，分别为1～38、79～234、255～281、290～321，最长无序区长度为165个氨基酸（图1-A）。
通过半定量PCR分析其在不同组织中的表达发现，EgrWRKY70主要在叶（包括嫩叶和成熟叶）、花和根中表达（图1-B），因此在后面的实验中选择叶片进行RNA提取和定量表达分析。除此之外，在3年生韧皮部有少量表达，而在3年生木质部和1年生茎部（包括木质部、韧皮部和皮层）没有或几乎看不到表达。说明EgrWRKY70表达具有组织特异性。
2.2 多重比较和进化树分析
通过与其他物种WRKY家族蛋白进行多重序列比对分析表明，所有植物中的WRKY70家族都只有一个保守的氨基酸WRKY序列，属于WRKY转录因子III a类成员。利用NCBI中的Blast程序对EgrWRKY70编码蛋白与其它植物中WRKY70蛋白进行同源性分析（图2），结果表明蛋白EgrWRKY70与拟南芥、大豆、杨树、麻疯树、可可等WRKY70蛋白同源性为39%～58%，同时这些蛋白都具有5个明显的保守结构域。将不同植物的WRKY70蛋白聚类分析表明，桉树与麻风树（Jatroph acurcas）亲缘关系最近，与毛果杨（Populus trichocarpa）、蓖麻（Ricinus communis）、可可（Theobron macacao）、棉花（Gossypium raimondii）、桃树（Prunus persicappa）中的WRKY70具有较近的亲源关系，聚类在一起，而作为草本植物的拟南芥与其他木本植物的WRKY70亲缘关系较远（图3）。进一步利用网站Expasy中Swiss Model程序同源建模，推测该蛋白的三维结构模型如图4所示。其结构与拟南芥的WRKY70蛋白类似，可以推知EgrWRKY70蛋白与拟南芥WRKY70蛋白有相似的生物学功能。
2.3 基因对不同处理的响应
从图5可以看到，在BR、SA、MeJA处理后，EgrWRKY70基因通过表达量明显提高快速响应外源激素的变化，其中SA处理1 h时，EgrWRKY70基因表达量约是对照的21.81倍，而BR和MeJA处理6 h时，EgrWRKY70基因的转录水平分别为对照的10.55和3.03倍（图5-A、B、C）。而在经过24 h或168 h后，EgrWRKY70基因的表达量恢复到正常水平。表明EgrWRKY70能够快速响应BR、SA、MeJA外源激素的处理。
尽管如此，EgrWRKY70应对非生物胁迫时呈现出不同的调控方式。本研究中，在盐处理1 h时，EgrWRKY70能够对盐胁迫做出快速的反应，其表达量达到对照的14.35倍（图5-D）。除此之外，随着时间延长，EgrWRKY70基因表达量略微降低，但与对照相比，其表达量仍然维持在一个较高的水平。同时在长期处理（168 h）时EgrWRKY70基因的表达量达到对照的28.26倍。说明EgrWRKY70在短期和长期盐胁迫响应表达量一直维持着较高的水平来调控巨桉应对盐胁迫。在冷处理响应中EgrWRKY70则表现出快速响应，在2 h和4 h达到对照表达量的7.08和3.40倍，然后表达量恢复到正常水平（图5-E）。这些都说明EgrWRKY70在对于不同的逆境胁迫存在着不同的响应方式，这些不同的响应方式也意味着桉树在不同的逆境条件下EgrWRKY70的调控途径以及调控机制存在着差异。
3 讨论与结论
在早期的研究中已发现水杨酸、油菜素内酯、茉莉酸甲酯等生长调节剂在应对生物胁迫及非生物胁迫反应的重要信号分子，能诱导多种植物对生物和非生物胁迫产生持续抗性，减缓植物对包括病原菌侵染等多种逆境胁迫的伤害[19-22]。WRKY70是WRKY转录因子III a类成员，在生物胁迫过程中参与到植物防御过程，WRKY70突变体植株表现出对白粉菌（Erysiphe cichoracearum）和霜霉病菌（Hyaloperonospora parasitica）更加敏感，而值得注意的是更加耐黑斑病菌（Alternaria brassicicola）[14]。与之相反，过表达WRKY70基因会提高植物对黑斑病菌（Alternaria brassicicola）的抗性，但会降低植物对白粉菌的抗性[14]。在此过程中会引起几个JA响应基因的抑制，而部分通过NPR1来执行，表明WRKY70在调控依赖SA和JA防御途径中的平衡作用中起到重要作用[8，14]。除此之外，AtWRKY70作用于防御相关的活性氧中间物和SA下游，作为基本防御机制的主要成员，被RPP4或RPP7引发，参与到RPP4调控的防御[12]。而突变体wrky46wrky70和wrky46wrky70wrky53表现出对病菌的敏感性增加，病害表型更加明显。说明WRKY70与其结构相似且功能冗余的同源基因WRKY46、WRKY53共同调控对丁香假单胞杆菌的基础防御[13]。在本研究中通过外施水杨酸、油菜素内酯、茉莉酸甲酯到桉树叶片发现EgrWRKY70呈现出不同的表达变化，其中外施水杨酸和油菜素内酯时EgrWRKY70的表达量快速升高，尤其是在外施水杨酸时EgrWRKY70基因在1 h后的表达量大幅度增加。而在前期的研究中未发现通过外施水杨酸能够诱导桉树对青枯菌的抗性[23-24]，这也预示着EgrWRKY70可能会在诱导桉树青枯病抗性中起到正调控作用。值得注意的是在茉莉酸甲酯外施处理时，EgrWRKY70表达量变化较小甚至没有变化，这可能是与拟南芥中WRKY70的作用方式不同。同时，在本研究中还发现其在盐胁迫和冷胁迫中能过快速的响应和表达，尤其在盐胁迫时能够持续的表达，说明EgrWRKY70可能在非生物胁迫中也起到重要的调控作用。这与拟南芥中报道的WRKY70和WRKY54响应渗透压胁迫时响应类似[25]，可能是WRKY70主要响应盐胁迫中的渗透压胁迫。