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【摘要】目的：观察川芎嗪对d-半乳糖所致AD模型大鼠学习记忆功能和海马Schaffer侧枝-CA1通路LTP的影响，并探讨其可能机制。方法：24只大鼠随机分为对照组、模型组和TMP组，以d-半乳糖注射建立衰老大鼠模型，TMP组腹腔注射TMP干预。水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力，电生理实验比较强直刺激前后海马CA1区PS幅度变化。结果：在水迷宫实验中，模型组大鼠潜伏期延长，错误次数增多，TMP明显改善衰老大鼠学习记忆功能。电生理实验中，模型组强直刺激后平均PS增幅明显低于对照组，TMP组能提高衰老大鼠PS增幅。结论：TMP能提高衰老大鼠的空间学习和记忆能力，其机制可能与TMP能改善d-半乳糖对大鼠海马CA1区LTP的抑制有关。
【关键词】川芎嗪；学习记忆；海马CA1区；长时程增强
【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）01-0030-02
Abstract：Objective To observe the effects of tetramethylpyrazine on learning and memory capability and synaptic plasticity in hippocampal CA1 of aging rats induced by D-galactose. Methods 24 SD rats were randomized into control group， The models of aging rats were made by given injecting D-galactose （120mg·kg-1·d-1）， The rats in the TMP group were treated with TMP solution （10mg·kg-1·d-1， ip ）， the rats in the control group were treated with the same dose of saline. After 28 days， the learning and memory capability were detected in Morris water maze. At the end of the experiment， electrophysiological method was used to observe the LTP in hippocampal CA1 area. Results The Morris water maze test showed that TMP significantly improved learning and memory performance in aging rats. In the electrophysiological experiments， PS amplitude significantly decreased in model group versus control， and TMP treatment restored PS amplitude. Conclusion TMP can improve learning and memory capability and synaptic plasticity in the hippocampal CA1 of aging rats， and this effect could be attributed to improvement of synaptic dysfunction.
Keywords：TMP；learning and memory；hippocampal CA1；LTP
阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种表现为认知功能下降、学习记忆能力减退的神经退行性病变[1]。海马结构在学习记忆功能中起重要作用，长时程增强（long-term potentiation，LTP）是突触可塑性变化的一种基本类型，表现为突触传递效能的持续增强，被认为是学习与记忆的生物学基础和研究的良好模型[2]。川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是传统中药川芎的有效成分之一，除具有改善微循环，保护心、脑血管和防治心脑缺血等功效外，近年也来有报道称TMP具有改善学习记忆功能[3]。本研究通过Morris水迷宫试验观察川芎嗪对AD模型大鼠学习记忆功能影响，采用在体细胞外电位记录方法检测海马CA1区LTP的变化，并对其作用机制进行探讨。
1仪器与材料
11实验动物24只Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重为180～220g（由武汉大学医学部动物实验中心提供），雌雄不拘。饲养过程中，室温23℃左右，保持通风，每日光照时间10h。随机表法将动物随机分为3组：对照组、模型组与TMP组。模型组和TMP组用5%d-半乳糖溶液按120mg/（kg·d）的剂量颈后部皮下注射，对照组注射同剂量的生理盐水。同时，TMP组每天腹腔注射TMP 10mg/kg，对照组和模型组注射同剂量生理盐水。42d后开始进行水迷宫实验。
12仪器与试剂Morris水迷宫系统（北京微信斯达科技公司）；江湾I-C型立体定向仪（第二军医大学器材处）；RM6240B型多道生理信号采集系统（成都仪器厂）；盐酸川芎嗪为河南福森药业产品；d-半乳糖购于上海试剂二厂。
2实验方法
21Morris水迷宫测试水迷宫测试包括定位航行试验和空间搜索试验，测试具体方法如以前文献[4]所述，大鼠学习和记忆的能力用定位航行试验进行评估，随机在迷宫中设立入水点，大鼠入水后，记录潜伏期（即从入水到找到并爬上平台所需时间），每日进行训练2次持续5d。大鼠空间位置记忆能力的评估采用空间搜索试验，在水迷宫训练的第6天，撤除水平台，将大鼠在任选的入水点放入水中，测定在120s内跨过水迷宫四个象限原平台相应所在位置的次数，以正确探索次数（穿越原平台所在象限相应位置的次数）和错误次数（穿越非原平台所在其它三个象限相应位置的总次数）来评估。 22电生理实验在Morris迷宫实验结束后，单刺激海马Schaffer侧枝诱发CA1区场电位。强直刺激诱导海马诱发场电位LTP。动物手术、刺激参数及记录方法同文献[4]。再给予相同参数的单刺激至少在2h以上。记录并对比强直刺激前后海马CA1区场电位幅度。
23电极部位的鉴定记录结束后处死动物，对电极记录部位进行组织学鉴定。刺激位置和记录点正确的纳入统计学处理。
24统计分析数据以均数±标准误的形式表示，用SPSS170软件进行单因素方差分析，P<005表示差别有统计学意义，应用Excel软件作图。
3结果
31水迷宫实验结果
311定向航行试验在训练开始的第一天，各组潜伏期数据之间无差异（P>005）。自训练的第二天起，各组潜伏期均出现逐次缩短的趋势，但模型组大鼠寻找平台时间明显慢于对照组，经统计学检验，差异有统计学意义（P<005）；同模型组相比，TMP组潜伏期下降明显，差异具有统计学意义（P<005）。试验中潜伏期变化见图1。
[FK（W][FK）]
312空间搜索试验该试验中，模型组大鼠穿越目标平台位置的平均正确探索次数为 （712±079） 次，明显少于对照组数值 （1563±094）次，经检验差异有统计学意义（P<005）。TMP组大鼠穿越目标平台平均次数为（1387±083）次，高于模型组的平均值（P<005）。各组不同象限穿越次数百分比（穿越该象限原平台位置的次数占总次数的百分比）如图2所示。
32海马细胞外电位记录在全部24只大鼠，单刺激海马Schaffer纤维均在海马CA1区诱导出潜伏期和幅度稳定的群体峰电位（population spike，PS）。在对照组观察到PS幅度在强直刺激后5min开始增大至强直刺激前PS平均值的（15834±296）%，最大可增至（19736±319）%，这种突触效能的增大维持2h也并未衰减，即诱导出海马CA1区LTP，强直刺激前后PS幅值的差异有统计学意义（P<005）。
在模型组，强直刺激后平均PS幅值为强直刺激前的（12256±317）%，明显低于对照组强直刺激后平均PS增幅（18270±286）%， P<005表明差别有统计学意义，d-半乳糖所致衰老大鼠海马CA1区的LTP受到明显抑制（见图3）。
TMP组强直刺激后平均增幅为（16483±306）%，高于模型组，差异有统计学意义（P<005），表明TMP腹腔注射对d-半乳糖所致衰老大鼠海马CA1区LTP的抑制起到了较好的改善作用。
4讨论
学习能力减退和空间记忆障碍是AD的主要表现。包括LTP的突触可塑性变化被认为是学习、记忆功能的可能机制之一[5]，AD的学习记忆功能减退与海马突触可塑性的变化有着重要的关系[6]。在本次Morris水迷宫实验中，同对照组相比，模型组大鼠通过训练寻找平台的潜伏期下降速度迟缓，在空间搜索实验中错误率高，表明AD模型组造模成功，d-半乳糖注射后，大鼠的空间学习和记忆能力明显受损，模型组大鼠海马CA1区LTP幅度明显降低，d-半乳糖皮下注射导致大鼠学习记忆能力减退的同时还出现了大鼠海马CA1区LTP，表明AD大鼠学习记忆功能障碍与海马LTP的抑制有关。
TMP组大鼠水迷宫实验中潜伏期降低速度明显高于模型组，对原平台位置的记忆清楚，错误次数少，表明TMP腹腔注射较好的改善了d-半乳糖所致大鼠学习记忆功能的损伤。同模型组相比，TMP腹腔注射可显著提高海马PS增幅，表明TMP对衰老大鼠学习记忆功能的保护作用可通过提高海马突触可塑性来实现。TMP在中枢神经系统中具有抑制细胞凋亡、提高超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮合成酶（NOS）的活性等作用[7]，并可抑制衰老时细胞内的Ca2+超载，保护神经元，这可能是TMP改善衰老大鼠海马LTP的机制。
参考文献
[1] Dumont M，Beal MF.Neuroprotective strategies involving ROS in Alzheimer disease[J].Free Radic Biol Med，2011， 51（7）：1014-1026.
[2] Korte M， Herrnlann U，Zhang X，et a1.The role of APP and APLP for synaptic transmission，plasticity，and network function：lessons from genetic mouse models[J].Exp Brain Res，2011，21（7）：435-440.
[3] 杨雪梅.川芎嗪药理作用研究进展[J].中国生化药物杂志，2010，31（3）：215-216.
[4] 杨坦，刘萍，丁玉琴.铅暴露对大鼠学习记忆功能和海马CA1区LTP的影响[J].医学信息，2008，21（6）：872-876.
[5] Martin S.J，Grimwood P.D，Morris R.G. Synaptic plasticity and memory： an evaluation of the hypothesis[J]. Annu Rev Neurosci .2000，35（23）： 649-711.
[6] Postina R，Schroeder A，Dewachter I，et a1.A disintegrin-metalloproteinase prevents amyloid plaque formation and hippocampal defects in an Alzheimer disease mouse model [J].Clin Invest，2004，13：1456-1464.
[7] 纳鑫.汪雪兰，皮荣标，等.川芎嗪对中枢神经系统的药理作用及其机制的研究进展[J].中药新药与临床药理，2008，18（1）：77-80.
（收稿日期：20141011）
【关键词】川芎嗪；学习记忆；海马CA1区；长时程增强
【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）01-0030-02
Abstract：Objective To observe the effects of tetramethylpyrazine on learning and memory capability and synaptic plasticity in hippocampal CA1 of aging rats induced by D-galactose. Methods 24 SD rats were randomized into control group， The models of aging rats were made by given injecting D-galactose （120mg·kg-1·d-1）， The rats in the TMP group were treated with TMP solution （10mg·kg-1·d-1， ip ）， the rats in the control group were treated with the same dose of saline. After 28 days， the learning and memory capability were detected in Morris water maze. At the end of the experiment， electrophysiological method was used to observe the LTP in hippocampal CA1 area. Results The Morris water maze test showed that TMP significantly improved learning and memory performance in aging rats. In the electrophysiological experiments， PS amplitude significantly decreased in model group versus control， and TMP treatment restored PS amplitude. Conclusion TMP can improve learning and memory capability and synaptic plasticity in the hippocampal CA1 of aging rats， and this effect could be attributed to improvement of synaptic dysfunction.
Keywords：TMP；learning and memory；hippocampal CA1；LTP
阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种表现为认知功能下降、学习记忆能力减退的神经退行性病变[1]。海马结构在学习记忆功能中起重要作用，长时程增强（long-term potentiation，LTP）是突触可塑性变化的一种基本类型，表现为突触传递效能的持续增强，被认为是学习与记忆的生物学基础和研究的良好模型[2]。川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是传统中药川芎的有效成分之一，除具有改善微循环，保护心、脑血管和防治心脑缺血等功效外，近年也来有报道称TMP具有改善学习记忆功能[3]。本研究通过Morris水迷宫试验观察川芎嗪对AD模型大鼠学习记忆功能影响，采用在体细胞外电位记录方法检测海马CA1区LTP的变化，并对其作用机制进行探讨。
1仪器与材料
11实验动物24只Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重为180～220g（由武汉大学医学部动物实验中心提供），雌雄不拘。饲养过程中，室温23℃左右，保持通风，每日光照时间10h。随机表法将动物随机分为3组：对照组、模型组与TMP组。模型组和TMP组用5%d-半乳糖溶液按120mg/（kg·d）的剂量颈后部皮下注射，对照组注射同剂量的生理盐水。同时，TMP组每天腹腔注射TMP 10mg/kg，对照组和模型组注射同剂量生理盐水。42d后开始进行水迷宫实验。
12仪器与试剂Morris水迷宫系统（北京微信斯达科技公司）；江湾I-C型立体定向仪（第二军医大学器材处）；RM6240B型多道生理信号采集系统（成都仪器厂）；盐酸川芎嗪为河南福森药业产品；d-半乳糖购于上海试剂二厂。
2实验方法
21Morris水迷宫测试水迷宫测试包括定位航行试验和空间搜索试验，测试具体方法如以前文献[4]所述，大鼠学习和记忆的能力用定位航行试验进行评估，随机在迷宫中设立入水点，大鼠入水后，记录潜伏期（即从入水到找到并爬上平台所需时间），每日进行训练2次持续5d。大鼠空间位置记忆能力的评估采用空间搜索试验，在水迷宫训练的第6天，撤除水平台，将大鼠在任选的入水点放入水中，测定在120s内跨过水迷宫四个象限原平台相应所在位置的次数，以正确探索次数（穿越原平台所在象限相应位置的次数）和错误次数（穿越非原平台所在其它三个象限相应位置的总次数）来评估。 22电生理实验在Morris迷宫实验结束后，单刺激海马Schaffer侧枝诱发CA1区场电位。强直刺激诱导海马诱发场电位LTP。动物手术、刺激参数及记录方法同文献[4]。再给予相同参数的单刺激至少在2h以上。记录并对比强直刺激前后海马CA1区场电位幅度。
23电极部位的鉴定记录结束后处死动物，对电极记录部位进行组织学鉴定。刺激位置和记录点正确的纳入统计学处理。
24统计分析数据以均数±标准误的形式表示，用SPSS170软件进行单因素方差分析，P<005表示差别有统计学意义，应用Excel软件作图。
3结果
31水迷宫实验结果
311定向航行试验在训练开始的第一天，各组潜伏期数据之间无差异（P>005）。自训练的第二天起，各组潜伏期均出现逐次缩短的趋势，但模型组大鼠寻找平台时间明显慢于对照组，经统计学检验，差异有统计学意义（P<005）；同模型组相比，TMP组潜伏期下降明显，差异具有统计学意义（P<005）。试验中潜伏期变化见图1。
[FK（W][FK）]
312空间搜索试验该试验中，模型组大鼠穿越目标平台位置的平均正确探索次数为 （712±079） 次，明显少于对照组数值 （1563±094）次，经检验差异有统计学意义（P<005）。TMP组大鼠穿越目标平台平均次数为（1387±083）次，高于模型组的平均值（P<005）。各组不同象限穿越次数百分比（穿越该象限原平台位置的次数占总次数的百分比）如图2所示。
32海马细胞外电位记录在全部24只大鼠，单刺激海马Schaffer纤维均在海马CA1区诱导出潜伏期和幅度稳定的群体峰电位（population spike，PS）。在对照组观察到PS幅度在强直刺激后5min开始增大至强直刺激前PS平均值的（15834±296）%，最大可增至（19736±319）%，这种突触效能的增大维持2h也并未衰减，即诱导出海马CA1区LTP，强直刺激前后PS幅值的差异有统计学意义（P<005）。
在模型组，强直刺激后平均PS幅值为强直刺激前的（12256±317）%，明显低于对照组强直刺激后平均PS增幅（18270±286）%， P<005表明差别有统计学意义，d-半乳糖所致衰老大鼠海马CA1区的LTP受到明显抑制（见图3）。
TMP组强直刺激后平均增幅为（16483±306）%，高于模型组，差异有统计学意义（P<005），表明TMP腹腔注射对d-半乳糖所致衰老大鼠海马CA1区LTP的抑制起到了较好的改善作用。
4讨论
学习能力减退和空间记忆障碍是AD的主要表现。包括LTP的突触可塑性变化被认为是学习、记忆功能的可能机制之一[5]，AD的学习记忆功能减退与海马突触可塑性的变化有着重要的关系[6]。在本次Morris水迷宫实验中，同对照组相比，模型组大鼠通过训练寻找平台的潜伏期下降速度迟缓，在空间搜索实验中错误率高，表明AD模型组造模成功，d-半乳糖注射后，大鼠的空间学习和记忆能力明显受损，模型组大鼠海马CA1区LTP幅度明显降低，d-半乳糖皮下注射导致大鼠学习记忆能力减退的同时还出现了大鼠海马CA1区LTP，表明AD大鼠学习记忆功能障碍与海马LTP的抑制有关。
TMP组大鼠水迷宫实验中潜伏期降低速度明显高于模型组，对原平台位置的记忆清楚，错误次数少，表明TMP腹腔注射较好的改善了d-半乳糖所致大鼠学习记忆功能的损伤。同模型组相比，TMP腹腔注射可显著提高海马PS增幅，表明TMP对衰老大鼠学习记忆功能的保护作用可通过提高海马突触可塑性来实现。TMP在中枢神经系统中具有抑制细胞凋亡、提高超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮合成酶（NOS）的活性等作用[7]，并可抑制衰老时细胞内的Ca2+超载，保护神经元，这可能是TMP改善衰老大鼠海马LTP的机制。
参考文献
[1] Dumont M，Beal MF.Neuroprotective strategies involving ROS in Alzheimer disease[J].Free Radic Biol Med，2011， 51（7）：1014-1026.
[2] Korte M， Herrnlann U，Zhang X，et a1.The role of APP and APLP for synaptic transmission，plasticity，and network function：lessons from genetic mouse models[J].Exp Brain Res，2011，21（7）：435-440.
[3] 杨雪梅.川芎嗪药理作用研究进展[J].中国生化药物杂志，2010，31（3）：215-216.
[4] 杨坦，刘萍，丁玉琴.铅暴露对大鼠学习记忆功能和海马CA1区LTP的影响[J].医学信息，2008，21（6）：872-876.
[5] Martin S.J，Grimwood P.D，Morris R.G. Synaptic plasticity and memory： an evaluation of the hypothesis[J]. Annu Rev Neurosci .2000，35（23）： 649-711.
[6] Postina R，Schroeder A，Dewachter I，et a1.A disintegrin-metalloproteinase prevents amyloid plaque formation and hippocampal defects in an Alzheimer disease mouse model [J].Clin Invest，2004，13：1456-1464.
[7] 纳鑫.汪雪兰，皮荣标，等.川芎嗪对中枢神经系统的药理作用及其机制的研究进展[J].中药新药与临床药理，2008，18（1）：77-80.
（收稿日期：20141011）