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摘要： Xanthmonas citri subsp. malvacearum （Xcm）是棉花角斑病的病原，由于缺乏适合的遗传驯化体系，难于对其特定的基因进行研究，所以建立高效的基因缺失突变系统，是迫切需要解决的问题。采用去甲基化氮胞苷（5-AZA）驯化野生菌株Xcm 8号小种菌株V8和V8无细胞胞外物（CFEs）驯化重组质粒pK18mobsacB：：N1012及pK18mobsacB：：m762这2种驯化方法，以来自V8的hpaXmN和hpaXm为靶基因验证其有效性。结果表明，成功获得了△hpaXmN和△hpaXm突变体；虽然2种驯化方式都能获得转化子，但驯化菌株的电转化效率是驯化质粒的10～100倍。遗传驯化体系的建立消除了Xcm V8由于限制修饰系统引起的转化障碍，实现了特定基因的定点突变，为后续获得Xcm V8其他基因缺失突变体奠定了基础。
关键词： 棉花角斑病菌Xcm V8；遗传体系；驯化；定点突变
中图分类号： S435.621.2 5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0153-05
黃单胞菌属（Xanthomonas）是植物病原菌中较大的类群[1]，随着细菌基因组学的发展，几种主要致病菌[2-3]在 NCBI 里已经得到测序，包括34种Xanthomonas campestris、1种Xanthomonas oryzae、1种Xanthomonas axonopodis。这使得T3SS效应分子[4]、相关效应蛋白[5-6]及hrp基因功能[7]等的研究更加深入。
电转化技术是自1982年发展起来的，虽然广泛应用于细菌遗传转化的研究，但目前向原核细胞导入外源DNA仍很困难[8]。研究证实，以革兰氏阴性细菌为代表的Haemophilus parasuis SH0165共有33个限制内切酶和甲基转移酶基因，限制酶通常和它相伴的修饰酶组合成限制修饰系统，Jansen等于1995年发现限制修饰系统是导致不同菌株转化效率差异的重要因素[9]。R-M系统由Hha 1 endonuclease和Hha 1 methylase基因构成，有报道认为其能抑制细菌基因组外来的DNA交换引起的变化，降解异源DNA，进而保护细菌[10]。
目前，对存在限制性修饰系统的细菌驯化方法主要有：（1）去甲基化氮胞苷（5-AZA）驯化野生菌株，得到R-M系统突变菌用于遗传转化[10]；（2）采用CFEs体外甲基化后的质粒转化Haemophilus parasuis，转化效率由0提高到100～1 000 CFU/μg DNA[9]；（3）通过基因敲除构建运动发酵单胞菌的限制修饰系统突变菌以提高电转效率 [11] 。目前，已经用5-AZA成功驯化的R-M系统突变的黄单胞菌水稻白叶枯病菌有国际通用的PXO99A和中国水稻白叶枯病菌的KS6-6A、OS198A和YN2A[10]。
油菜黄单胞菌锦葵致病变种Xanthmonas citri subsp. malvacearum（Xcm） 是棉花角斑病的致病菌，该病在全世界棉花种植区都会发生，但研究大多集中在棉花角斑病的危害、发病条件及致病小种分化等[12-13]。本研究分别采用驯化方法1和2，以Xcm 的8号小种 V8（简称V8）的hpaXmN和hpaXm基因为例[14]，成功获得△hpaXmN和△hpaXm突变菌，实现特定基因的定点突变，为后续获得Xcm其他基因缺失突变体奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 菌株和试剂
大肠杆菌感受态DH5α，购自全式金公司；棉花角斑病菌Xanthmonas citri subsp. malvacearum（Xcm）V8菌株（8号小种），由笔者所在实验室从棉花上分离；质粒pK18mobsacB，南京农业大学董汉松教授惠赠。
卡那霉素（Km，50 mg/mL）、去甲基化氮胞苷（5-AZA）、Tris-base、乙酸钾、二硫苏糖醇、Na2EDTA、冰乙酸、S-腺苷甲硫氨酸溶液（SAM）、异丙醇、苯酚、氯仿等（solarbio）；核酸内切酶BamHⅠ、XbaⅠ、T4 DNA Ligase酶、Primer STAR GXL聚合酶（TaKaRa）；质粒提取试剂盒（南京捷贝斯）、胶回收试剂盒购、纯化试剂盒（TaKaRa）、细菌基因组DNA提取试剂盒（天根）。
1.2 主要溶液的配制
参照吴东方的方法[9]配制。
1.3 重组质粒pK18mobsacB：：N1012和pK18mobsacB：：m762的驯化
1.3.1 重组质粒的构建 以V8菌株基因组DNA为模板，利用引物hpaXmN-U-F/hpaXmN-U-R，hpaXmN-D-F/hpaXmN-D-R分别PCR获得hpaXmN-L 503 bp和hpaXmN-R 525 bp的片段（表1）。再利用hpaXmN-U-F和hpaXmN-D-R将上述2个片段通过overlap PCR[15]融合成1 020 bp的片段。接着对融合片段 BamHⅠ和 XbaⅠ 双酶切获得1 012 bp的片段，经T4 DNA Ligase连在经相同酶切的pK18mobsacB上，得重组质粒pK18mobsacB：：N1012。同理引物hpaXm-U-F/hpaXm-U-R，hpaXm-D-F/hpaXm-D-R 分别PCR得hpaXm-L 305 bp和hpaXm-R 473 bp的片段，经上述操作，得重组质粒pK18mobsacB：：m762。所用酶切、连接等方法参照文献[16]。
1.3.2 重组质粒的驯化 提取V8菌株的CFEs和CFEs体外甲基化质粒的反应体系参照吴东方的方法[9]。
1.4 V8菌株的驯化
挑取活化的V8菌株单菌落接种于浓度为0.1 μmol/L的去甲基化氮胞苷（azacytidine，5-AZA） NA平板，长出单菌落后，挑取单克隆接种于1 μmol/L 5-AZA的NA平板继续筛选，直至得到适合做遗传转化且抗150 μmol/L 5-AZA的V8菌株[10]。
关键词： 棉花角斑病菌Xcm V8；遗传体系；驯化；定点突变
中图分类号： S435.621.2 5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0153-05
黃单胞菌属（Xanthomonas）是植物病原菌中较大的类群[1]，随着细菌基因组学的发展，几种主要致病菌[2-3]在 NCBI 里已经得到测序，包括34种Xanthomonas campestris、1种Xanthomonas oryzae、1种Xanthomonas axonopodis。这使得T3SS效应分子[4]、相关效应蛋白[5-6]及hrp基因功能[7]等的研究更加深入。
电转化技术是自1982年发展起来的，虽然广泛应用于细菌遗传转化的研究，但目前向原核细胞导入外源DNA仍很困难[8]。研究证实，以革兰氏阴性细菌为代表的Haemophilus parasuis SH0165共有33个限制内切酶和甲基转移酶基因，限制酶通常和它相伴的修饰酶组合成限制修饰系统，Jansen等于1995年发现限制修饰系统是导致不同菌株转化效率差异的重要因素[9]。R-M系统由Hha 1 endonuclease和Hha 1 methylase基因构成，有报道认为其能抑制细菌基因组外来的DNA交换引起的变化，降解异源DNA，进而保护细菌[10]。
目前，对存在限制性修饰系统的细菌驯化方法主要有：（1）去甲基化氮胞苷（5-AZA）驯化野生菌株，得到R-M系统突变菌用于遗传转化[10]；（2）采用CFEs体外甲基化后的质粒转化Haemophilus parasuis，转化效率由0提高到100～1 000 CFU/μg DNA[9]；（3）通过基因敲除构建运动发酵单胞菌的限制修饰系统突变菌以提高电转效率 [11] 。目前，已经用5-AZA成功驯化的R-M系统突变的黄单胞菌水稻白叶枯病菌有国际通用的PXO99A和中国水稻白叶枯病菌的KS6-6A、OS198A和YN2A[10]。
油菜黄单胞菌锦葵致病变种Xanthmonas citri subsp. malvacearum（Xcm） 是棉花角斑病的致病菌，该病在全世界棉花种植区都会发生，但研究大多集中在棉花角斑病的危害、发病条件及致病小种分化等[12-13]。本研究分别采用驯化方法1和2，以Xcm 的8号小种 V8（简称V8）的hpaXmN和hpaXm基因为例[14]，成功获得△hpaXmN和△hpaXm突变菌，实现特定基因的定点突变，为后续获得Xcm其他基因缺失突变体奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 菌株和试剂
大肠杆菌感受态DH5α，购自全式金公司；棉花角斑病菌Xanthmonas citri subsp. malvacearum（Xcm）V8菌株（8号小种），由笔者所在实验室从棉花上分离；质粒pK18mobsacB，南京农业大学董汉松教授惠赠。
卡那霉素（Km，50 mg/mL）、去甲基化氮胞苷（5-AZA）、Tris-base、乙酸钾、二硫苏糖醇、Na2EDTA、冰乙酸、S-腺苷甲硫氨酸溶液（SAM）、异丙醇、苯酚、氯仿等（solarbio）；核酸内切酶BamHⅠ、XbaⅠ、T4 DNA Ligase酶、Primer STAR GXL聚合酶（TaKaRa）；质粒提取试剂盒（南京捷贝斯）、胶回收试剂盒购、纯化试剂盒（TaKaRa）、细菌基因组DNA提取试剂盒（天根）。
1.2 主要溶液的配制
参照吴东方的方法[9]配制。
1.3 重组质粒pK18mobsacB：：N1012和pK18mobsacB：：m762的驯化
1.3.1 重组质粒的构建 以V8菌株基因组DNA为模板，利用引物hpaXmN-U-F/hpaXmN-U-R，hpaXmN-D-F/hpaXmN-D-R分别PCR获得hpaXmN-L 503 bp和hpaXmN-R 525 bp的片段（表1）。再利用hpaXmN-U-F和hpaXmN-D-R将上述2个片段通过overlap PCR[15]融合成1 020 bp的片段。接着对融合片段 BamHⅠ和 XbaⅠ 双酶切获得1 012 bp的片段，经T4 DNA Ligase连在经相同酶切的pK18mobsacB上，得重组质粒pK18mobsacB：：N1012。同理引物hpaXm-U-F/hpaXm-U-R，hpaXm-D-F/hpaXm-D-R 分别PCR得hpaXm-L 305 bp和hpaXm-R 473 bp的片段，经上述操作，得重组质粒pK18mobsacB：：m762。所用酶切、连接等方法参照文献[16]。
1.3.2 重组质粒的驯化 提取V8菌株的CFEs和CFEs体外甲基化质粒的反应体系参照吴东方的方法[9]。
1.4 V8菌株的驯化
挑取活化的V8菌株单菌落接种于浓度为0.1 μmol/L的去甲基化氮胞苷（azacytidine，5-AZA） NA平板，长出单菌落后，挑取单克隆接种于1 μmol/L 5-AZA的NA平板继续筛选，直至得到适合做遗传转化且抗150 μmol/L 5-AZA的V8菌株[10]。