【摘 要】
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目的:将基于连接反应的可环化探针(circularizable oligonucleotide probe, C-probe)技术用于基因芯片对单碱基突变的检测.方法:可环化探针是一种检测核酸分子中单碱基突变的
【机 构】
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军事医学科学院放射医学研究所,北京,100850
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目的:将基于连接反应的可环化探针(circularizable oligonucleotide probe, C-probe)技术用于基因芯片对单碱基突变的检测.方法:可环化探针是一种检测核酸分子中单碱基突变的线性寡核苷酸分子,中间部分是通用引物结合区(约40 mer),5′端与3′端是两段与待检测的DNA分子中靶序列互补的目标序列识别区(各约20 mer).与靶序列互补结合后,可环化探针的两个末端在空间靠近并在DNA连接酶的作用下连接形成环状分子,利用荧光分子标记的通用引物对连接产物进行PCR扩增,再利用基因芯片检测荧光标记的PCR产物,从而确定所检测的核苷酸位点的性质.本实验以检测CYP3A4基因外显子5中14 026位点的单核苷酸多态性为例,优化了连接反应、荧光标记通用引物的PCR扩增以及探针杂交检测等条件,并用该方法对合成模板和人基因组DNA标本进行检测.结果:以合成的寡核苷酸序列为模板进行10倍系列稀释,确定可环化探针的检测灵敏度,PCR产物的凝胶电泳结果表明,检测灵敏度达到103拷贝;可环化探针对合成的野生型和突变型模板具有良好的区分效果.用该方法检测人基因组DNA标本,芯片检测结果与测序结果符合,证实了该方法的可行性.结论:连接反应是最具特异性的酶促反应,将其与基因芯片技术结合用于单碱基突变检测,有助于简化荧光标记过程,提高检测结果的准确性.
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