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摘 要：Persisters是野生型细菌的一种表型变异，对抗生素具有高耐受性的休眠的细胞亚群，通过减少其新陈代谢并进入休眠状态从而在抗生素治疗中存活下来，并在抗生素去除后恢复生长，是造成抗生素治疗顽固性和感染性疾病复发的主要原因之一。本文将对persisters的生物学特征、产生机制以及清除策略等内容作一综述。
关键词：persisters;毒素抗毒素系统;抗菌机制
Persisters这个概念是1944年都柏林大学医学博士bigger首次提出的，他在研究青霉素杀死金黄色葡萄球菌的过程中发现，大部分细菌都被杀死但总有一小部分细菌培养物（约占细菌种群的1%）存活下来，存活下來的这部分细菌可以重新增殖并对青霉素保持相同的敏感性，为了与传统意义上的耐药菌相区分，他将这部分细菌命名为“persisters”。与众所周知的由基因突变或水平基因转移引起的抗生素耐药性不同，persisters并没有遗传上的改变，最小抑菌浓度（MIC）不会增大，这种不发生任何抗性基因突变、仅以非增殖小亚群形式耐受抗生素的现象称为“persistence” [1]。Persisters的特点可概括为低活性、多药耐受、短暂表型性和生长异质性。休眠的persisters不会影响药物与相应靶点的结合，但由于其低下的代谢活动，会导致抗菌药物无法发挥杀菌作用，因而具有多种药物耐受的特性。
1 Persisters的产生机制
Persisters形成机制不遵循复杂细胞功能的单个线性调节途径的控制，它的形成机制比较复杂，受多种机制的调控，既可以自发随机产生，又可以在环境压力下诱导产生，目前对persisters的形成机制尚无定论，但普遍认为与营养限制、抗生素治疗、ppGpp（鸟苷四磷酸）调控、毒素—抗毒素系统（TA系统）、代谢调节等有关系。
1.1 营养限制
微生物在营养缺乏条件下生理机能将发生相当大的变化，这种变化发生在微生物群体生长的稳定阶段。有文献表明，细菌培养物在进入稳定期后开始积累persisters细胞。营养饥饿会触发persisters形成，例如，当培养基中的氨基酸或氮缺乏，部分细菌会进入persisters状态，导致抗生素治疗失效[2]。
1.2ppGpp调控
鸟苷四磷酸（alarmone guanosinetetraphosphate，PpGpp）作为胞内信号分子，介导细菌对环境胁迫产生的应激反应，是TA 系统的效应物质，主要参与细菌基因转录的调控。响应特定的压力，SpoT和RelA被激活以合成核苷酸警报蛋白ppGpp。增加的ppGpp水平通过抑制胞外磷酸酶（PPX）导致无机多磷酸盐（PolyP）的积累，降低PolyP。积累的PolyP与Lon蛋白酶优先结合，以裂解抗毒素HipB，导致过量的毒素HipA。作为回报，游离的活性毒素HipA通过其ATP结合位点Ser239的磷酸化使GltX失活，结果是不带电荷的tRNA带有谷氨酸（tRNAGlu）在细胞中积累。不带电荷的tRNAGlu负载在空的核糖体位点，并触发RelA激活更多ppGpp合成，从而促进细胞进入休眠状态形成persisters细胞[3]。
1.3TA系统
毒素 - 抗毒素系统位于质粒上，其编码能够抑制细胞生长的毒素蛋白和抵抗毒素的抗毒素。在正常生长条件下，抗毒素有效地抑制毒素的活性;而在应激条件下，抗毒素被选择性降解，释放毒素以抑制必需的细胞过程，如DNA复制和蛋白质翻译，从而导致生长停滞。TA系统在细菌耐药性和persister形成中发挥重要作用。目前根据它们对应的抗毒素的蛋白质组性质及其不同的调节机制将TA系统分为六类，被称为I-VI型TA系统。在I型和III型TA系统中，抗毒素是非编码RNA;在II型，IV型，V型和VI型TA系统中，抗毒素是一种蛋白质。II型TA系统是目前研究最多的，I型，II型和V型，涉及persister的形成[4]。
I型TA系统具有非编码RNA抗毒素和蛋白质毒素。在这个系统中，小分子反义RNA（sRNA）与毒素的mRNA碱基配对以抑制其翻译。在正常生长条件下，这种双链体抑制核糖体结合，并且迅速被RNase III降解。然而，在应激条件下，抗毒素sRNA库减少，导致现在非双链体毒素mRNA的翻译。II型TA系统是最大和研究最多的TA系统类，在大多数自由生活细菌中鉴定出数千个II型TA基因座。II型TA系统抗毒素和毒素都是蛋白质，抗毒素通常具有两个结构域，一个结合DNA，另一个结合并抑制同源蛋白毒素的活性。毒素和抗毒素两个基因的表达是由TA复合物在转录水平上调控的，该复合物涉及到启动子区域与回文序列的结合（抗毒素和大多数情况下TA复合物都结合TA启动子以抑制转录。）。在生长条件下，毒素与抗毒素结合，后者抑制其活性。在应激条件下，活化细胞蛋白酶如Lon和ClpXP，其优先裂解抗毒素，释放毒素以通过抑制翻译或复制来抑制生长。V型系统中，抗毒素（GhoS）是一种RNase（核糖核酸内切酶），在生长条件下裂解毒素（GhoT）mRNA。在应激条件下，GhoS的mRNA被II型毒素MqsR降解。
第一个TA基因座tisAB-istR-1参与了SOS对DNA损伤的应答， 该基因座编码一个有毒的基因tisAB和两个小RNA，即IstR-1和IstR-2。TisAB受LexA控制，并因此受到SOS反应的激活，但只有TisB对毒性负责。 istR-2的转录也受SOS调节，不参与TisB的控制，而抗毒素IstR-1与LexA依赖的启动子结合，并通过诱导tisB mRNA的RNase III依赖性切割来抑制TisB的表达。在没有SOS应答的情况下，通过诱导tisB mRNA的RNase III依赖性切割，将istR-1组成性转录为灭活TisAB的毒性。当环丙沙星引起DNA损伤时，它会激活RecA蛋白，从而导致LexA阻遏物裂解，然后引发SOS反应。控制Lex启动子的抗毒素IstR-1几乎被完全裂解，而毒素TisB逐渐积累并迅速结合到细胞质膜上，导致膜损伤，质子动力（pmf）和ATP水平降低。这导致DNA，RNA和蛋白质合成的速率降低，并且阻止了细胞吸收药物。结果，生长减慢并形成了耐多药的persisters。 1.4代谢调节
任何参与细菌物质合成和能量代谢的过程都可能与persisters形成相关，其涉及机制和系统冗繁。Lon 蛋白酶参与大肠埃希菌多种抗毒素蛋白的降解，lon 基因敲除株对氨苄西林和环丙沙星的persisters水平都降低，过表达Lon 蛋白的野生型细菌persisters水平明显升高，然而对于缺失10 个编码mRNA 内切酶的TA 基因座的突变株，persisters水平并没有明显变化[5]。营养缺乏激活Lon 或Clp 蛋白酶，降解抗毒素蛋白，释放HipA、RelE 等毒素蛋白。RelE裂解mRNA 或者通過ppGpp 依赖性信号转导途径诱导细胞生长停滞;HipA 能够磷酸化谷氨酰- tRNA 合成酶（ glutamyl - tRNA synthetase，Glt X）的293 位丝氨酸并抑制其活性，导致空载glu - tRNA 增加，激活RelA 引起严谨反应，合成ppGpp，导致细菌停止生长。
2 清除策略
研究发现[6]抗Perpersister化合物根据其作用机理，使用不同的策略杀死persisters细胞。可以通过干扰群体感应（M64），SOS响应（lexA3 inh。），persisters特定基因，固定相呼吸（NO）和严谨反应（relacin）来抑制persisters形成。其他策略包括通过刺激ROS的产生（Ag +，L-丝氨酸）或刺激细菌的新陈代谢，从而使persisters细胞对抗生素敏感，从而刺激抗生素靶标（C10，顺式-2-癸烯酸）。或者，可以通过改变pH梯度（L-精氨酸）和直接刺激氨基糖苷的摄取（L-丝氨酸，次离子休克，代谢产物）来增加抗生素的摄取。可以通过刺激非特异性蛋白酶活性（ADEP4，拉霉素），DNA交联（丝裂霉素C，顺铂）或膜去极化（硼霉素，HT61，NCK-10）来直接杀死persisters细胞。直接杀死persisters细胞的最常见策略是通过广泛破坏细菌膜。
3 展望
由于目前针对persisters形成机制研究的目标菌主要集中在大肠埃希菌，对于其他的细菌持留状态研究较少，因此，需要加强对其他细菌持留状态的研究，以进一步明晰不同细菌的持留机制是否具有保守性或差异性。寻找转化persisters的药物是控制慢性感染的关键，未来我们可以在中药或者天然化合物中寻找能够促进persisters向药物敏感状态转化的物质，根据persisters产生的机制寻找药物有效的作用靶点，也可以尝试研究联合用药先将persisters转化为抗生素敏感状态，再利用抗生素彻底消灭的方法。
参考文献：
[1]Bigger JW. Treatment of staphylococcal infections with penicillin. [J].Lancet 1944;244：497-500.
[2]Brown DR.Nitrogen starvation induces persister cell formation in Escheridhia coii.[J].Bacteriol，2019，201（3）：e00622-18.
[3]Rocker A，Meinhart A.Type II toxin：antitoxin systems.More than small selfish entities.Current genetics，2016，62（2）：287-290.
[4]Równicki M，Pieńko T，Czarnecki J，et al.Artificial Activation of Escherichia coli mazEF and hipBA Toxin-Antitoxin Systems by Antisense Peptide Nucleic Acids as an Antibacterial Strategy.Frontiers in microbiology，2018，9：2870.
[5]Maisonneuve E， Shakespeare LJ， Jorgensen MG， et al. Bacterial persistence by RNA endonucleases [J] . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2011， 108（32）：13206 - 13211.
[6]Conlon BP， Nakayasu ES， Fleck LE， et al. Activated ClpP kills persisters and eradicates a chronic biofilm infection [J]. Nature， 2013， 503（7476）： 365 - 370.
（辽宁师范大学生命科学学院）
关键词：persisters;毒素抗毒素系统;抗菌机制
Persisters这个概念是1944年都柏林大学医学博士bigger首次提出的，他在研究青霉素杀死金黄色葡萄球菌的过程中发现，大部分细菌都被杀死但总有一小部分细菌培养物（约占细菌种群的1%）存活下来，存活下來的这部分细菌可以重新增殖并对青霉素保持相同的敏感性，为了与传统意义上的耐药菌相区分，他将这部分细菌命名为“persisters”。与众所周知的由基因突变或水平基因转移引起的抗生素耐药性不同，persisters并没有遗传上的改变，最小抑菌浓度（MIC）不会增大，这种不发生任何抗性基因突变、仅以非增殖小亚群形式耐受抗生素的现象称为“persistence” [1]。Persisters的特点可概括为低活性、多药耐受、短暂表型性和生长异质性。休眠的persisters不会影响药物与相应靶点的结合，但由于其低下的代谢活动，会导致抗菌药物无法发挥杀菌作用，因而具有多种药物耐受的特性。
1 Persisters的产生机制
Persisters形成机制不遵循复杂细胞功能的单个线性调节途径的控制，它的形成机制比较复杂，受多种机制的调控，既可以自发随机产生，又可以在环境压力下诱导产生，目前对persisters的形成机制尚无定论，但普遍认为与营养限制、抗生素治疗、ppGpp（鸟苷四磷酸）调控、毒素—抗毒素系统（TA系统）、代谢调节等有关系。
1.1 营养限制
微生物在营养缺乏条件下生理机能将发生相当大的变化，这种变化发生在微生物群体生长的稳定阶段。有文献表明，细菌培养物在进入稳定期后开始积累persisters细胞。营养饥饿会触发persisters形成，例如，当培养基中的氨基酸或氮缺乏，部分细菌会进入persisters状态，导致抗生素治疗失效[2]。
1.2ppGpp调控
鸟苷四磷酸（alarmone guanosinetetraphosphate，PpGpp）作为胞内信号分子，介导细菌对环境胁迫产生的应激反应，是TA 系统的效应物质，主要参与细菌基因转录的调控。响应特定的压力，SpoT和RelA被激活以合成核苷酸警报蛋白ppGpp。增加的ppGpp水平通过抑制胞外磷酸酶（PPX）导致无机多磷酸盐（PolyP）的积累，降低PolyP。积累的PolyP与Lon蛋白酶优先结合，以裂解抗毒素HipB，导致过量的毒素HipA。作为回报，游离的活性毒素HipA通过其ATP结合位点Ser239的磷酸化使GltX失活，结果是不带电荷的tRNA带有谷氨酸（tRNAGlu）在细胞中积累。不带电荷的tRNAGlu负载在空的核糖体位点，并触发RelA激活更多ppGpp合成，从而促进细胞进入休眠状态形成persisters细胞[3]。
1.3TA系统
毒素 - 抗毒素系统位于质粒上，其编码能够抑制细胞生长的毒素蛋白和抵抗毒素的抗毒素。在正常生长条件下，抗毒素有效地抑制毒素的活性;而在应激条件下，抗毒素被选择性降解，释放毒素以抑制必需的细胞过程，如DNA复制和蛋白质翻译，从而导致生长停滞。TA系统在细菌耐药性和persister形成中发挥重要作用。目前根据它们对应的抗毒素的蛋白质组性质及其不同的调节机制将TA系统分为六类，被称为I-VI型TA系统。在I型和III型TA系统中，抗毒素是非编码RNA;在II型，IV型，V型和VI型TA系统中，抗毒素是一种蛋白质。II型TA系统是目前研究最多的，I型，II型和V型，涉及persister的形成[4]。
I型TA系统具有非编码RNA抗毒素和蛋白质毒素。在这个系统中，小分子反义RNA（sRNA）与毒素的mRNA碱基配对以抑制其翻译。在正常生长条件下，这种双链体抑制核糖体结合，并且迅速被RNase III降解。然而，在应激条件下，抗毒素sRNA库减少，导致现在非双链体毒素mRNA的翻译。II型TA系统是最大和研究最多的TA系统类，在大多数自由生活细菌中鉴定出数千个II型TA基因座。II型TA系统抗毒素和毒素都是蛋白质，抗毒素通常具有两个结构域，一个结合DNA，另一个结合并抑制同源蛋白毒素的活性。毒素和抗毒素两个基因的表达是由TA复合物在转录水平上调控的，该复合物涉及到启动子区域与回文序列的结合（抗毒素和大多数情况下TA复合物都结合TA启动子以抑制转录。）。在生长条件下，毒素与抗毒素结合，后者抑制其活性。在应激条件下，活化细胞蛋白酶如Lon和ClpXP，其优先裂解抗毒素，释放毒素以通过抑制翻译或复制来抑制生长。V型系统中，抗毒素（GhoS）是一种RNase（核糖核酸内切酶），在生长条件下裂解毒素（GhoT）mRNA。在应激条件下，GhoS的mRNA被II型毒素MqsR降解。
第一个TA基因座tisAB-istR-1参与了SOS对DNA损伤的应答， 该基因座编码一个有毒的基因tisAB和两个小RNA，即IstR-1和IstR-2。TisAB受LexA控制，并因此受到SOS反应的激活，但只有TisB对毒性负责。 istR-2的转录也受SOS调节，不参与TisB的控制，而抗毒素IstR-1与LexA依赖的启动子结合，并通过诱导tisB mRNA的RNase III依赖性切割来抑制TisB的表达。在没有SOS应答的情况下，通过诱导tisB mRNA的RNase III依赖性切割，将istR-1组成性转录为灭活TisAB的毒性。当环丙沙星引起DNA损伤时，它会激活RecA蛋白，从而导致LexA阻遏物裂解，然后引发SOS反应。控制Lex启动子的抗毒素IstR-1几乎被完全裂解，而毒素TisB逐渐积累并迅速结合到细胞质膜上，导致膜损伤，质子动力（pmf）和ATP水平降低。这导致DNA，RNA和蛋白质合成的速率降低，并且阻止了细胞吸收药物。结果，生长减慢并形成了耐多药的persisters。 1.4代谢调节
任何参与细菌物质合成和能量代谢的过程都可能与persisters形成相关，其涉及机制和系统冗繁。Lon 蛋白酶参与大肠埃希菌多种抗毒素蛋白的降解，lon 基因敲除株对氨苄西林和环丙沙星的persisters水平都降低，过表达Lon 蛋白的野生型细菌persisters水平明显升高，然而对于缺失10 个编码mRNA 内切酶的TA 基因座的突变株，persisters水平并没有明显变化[5]。营养缺乏激活Lon 或Clp 蛋白酶，降解抗毒素蛋白，释放HipA、RelE 等毒素蛋白。RelE裂解mRNA 或者通過ppGpp 依赖性信号转导途径诱导细胞生长停滞;HipA 能够磷酸化谷氨酰- tRNA 合成酶（ glutamyl - tRNA synthetase，Glt X）的293 位丝氨酸并抑制其活性，导致空载glu - tRNA 增加，激活RelA 引起严谨反应，合成ppGpp，导致细菌停止生长。
2 清除策略
研究发现[6]抗Perpersister化合物根据其作用机理，使用不同的策略杀死persisters细胞。可以通过干扰群体感应（M64），SOS响应（lexA3 inh。），persisters特定基因，固定相呼吸（NO）和严谨反应（relacin）来抑制persisters形成。其他策略包括通过刺激ROS的产生（Ag +，L-丝氨酸）或刺激细菌的新陈代谢，从而使persisters细胞对抗生素敏感，从而刺激抗生素靶标（C10，顺式-2-癸烯酸）。或者，可以通过改变pH梯度（L-精氨酸）和直接刺激氨基糖苷的摄取（L-丝氨酸，次离子休克，代谢产物）来增加抗生素的摄取。可以通过刺激非特异性蛋白酶活性（ADEP4，拉霉素），DNA交联（丝裂霉素C，顺铂）或膜去极化（硼霉素，HT61，NCK-10）来直接杀死persisters细胞。直接杀死persisters细胞的最常见策略是通过广泛破坏细菌膜。
3 展望
由于目前针对persisters形成机制研究的目标菌主要集中在大肠埃希菌，对于其他的细菌持留状态研究较少，因此，需要加强对其他细菌持留状态的研究，以进一步明晰不同细菌的持留机制是否具有保守性或差异性。寻找转化persisters的药物是控制慢性感染的关键，未来我们可以在中药或者天然化合物中寻找能够促进persisters向药物敏感状态转化的物质，根据persisters产生的机制寻找药物有效的作用靶点，也可以尝试研究联合用药先将persisters转化为抗生素敏感状态，再利用抗生素彻底消灭的方法。
参考文献：
[1]Bigger JW. Treatment of staphylococcal infections with penicillin. [J].Lancet 1944;244：497-500.
[2]Brown DR.Nitrogen starvation induces persister cell formation in Escheridhia coii.[J].Bacteriol，2019，201（3）：e00622-18.
[3]Rocker A，Meinhart A.Type II toxin：antitoxin systems.More than small selfish entities.Current genetics，2016，62（2）：287-290.
[4]Równicki M，Pieńko T，Czarnecki J，et al.Artificial Activation of Escherichia coli mazEF and hipBA Toxin-Antitoxin Systems by Antisense Peptide Nucleic Acids as an Antibacterial Strategy.Frontiers in microbiology，2018，9：2870.
[5]Maisonneuve E， Shakespeare LJ， Jorgensen MG， et al. Bacterial persistence by RNA endonucleases [J] . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2011， 108（32）：13206 - 13211.
[6]Conlon BP， Nakayasu ES， Fleck LE， et al. Activated ClpP kills persisters and eradicates a chronic biofilm infection [J]. Nature， 2013， 503（7476）： 365 - 370.
（辽宁师范大学生命科学学院）