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【摘 要】目的:建立高效液相色谱法测定益智健脑胶囊中补骨脂素的含量。方法:采用AgiLent1 200serier SB-C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),乙腈-水(40∶60)为流动相,流速为1.0 mL·min-1,柱温为室温,进样量为10 μL,检测波长为250 nm。结果:补骨脂素在25.06~250.60 μmg/mL范围内线性关系良好,r=0.999 94,平均回收率为98.97%,RSD=0.61%,补骨脂素与供试品中其他组分色谱峰达到基线分离,分离度良好,补骨脂素峰理论塔板数不低于4 000。该法简便、快速、专属性好,结果准确、可靠。
【关键词】补骨脂素;益智健脑胶囊;高效液相色谱法;含量
【中图分类号】R286 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688(2016)10-0071-04
益智健脑胶囊为广西强寿药业集团有限责任公司在研新药品种,由五指毛桃、扶芳藤、牛大力、千斤拔、红参、熟地黄、肉苁蓉、山茱萸、当归、肉桂、三七、升麻、甘草等13味中药组成,具有补肾益脾、健脑生髓的功效,用于脾肾不足、精血亏虚所致健忘头昏、步态不稳、倦态食少、腰膝酸软等症。临床上用于主治脑萎缩(痴呆症)、中风后遗症等疾病。处方中的君药为五指毛桃。五指毛桃又名南芪、五爪龙、五指牛奶、土北芪,具有健脾利湿、益肺止咳、舒筋通络之功效[1],临床上主要用于脾虚浮肿、食少无力、肝炎、风湿痹痛、肺痨咳嗽等症。研究表明,五指毛桃含有补骨脂素、十六酸、佛手内酯、油酸等化合物[2-3],其中补骨脂素为其主要成分,可作为本品含量测定基准物进行研究,以保证新药益智健脑胶囊的产品质量。
脑萎缩症是老年人的常见病和多发病,常发生于50岁以上,病程可达数年至数十年,男性多于女性,脑萎缩有弥漫性脑萎缩(包括皮层萎缩、小脑萎缩及皮层、小脑、脑干萎缩)及局限性脑萎缩(多见于局限性脑器质性病变后如外伤、血管病、颅内局限性感染后等),其中弥漫性脑萎缩以痴呆、智能减退、记忆障碍、性格改变、行为障碍为主。有的伴有偏瘫和癫痫发作。局灶性脑萎缩以性格改变为主;小脑萎缩以语言障碍及形体的共济失调和震颤为主。
脑萎缩的原因是很多方面的。由于年老血液成分异常等因素,血液的黏稠度增高,使血流缓慢、血流量减少,致使正常的机能活动所需的能量减少;且年老微循环发生障碍,微循环网血液不畅,则记忆商可降低;老年人动脉含氧量降低,使脑细胞陷于相对缺氧,可引起脑细胞合成各种酶和神经传导质的量减少,均可导致脑萎缩。此外,遗传在本病的发生过程中也起了一定作用,衰老的过程、代谢障碍、内分泌机能减退等因素也与发病相关。
中医学认为,脑萎缩症属于先天禀赋不足,肾元亏虚或疾病迁延日久,气血不足,脑髓不充,筋脉失养所致;或因情志失调、气机不畅、气滞血瘀致使五脏功能失调使然,其中以肾元亏虚为本。肾受五脏六腑之精而藏之,且生髓并上注于脑,使髓海充养,髓海有余,则轻劲多力,自过其度。此外,本病与肝、脾二脏功能失调,亦有着十分密切的关系。因此,补肾健脾是治疗本病的根本,益智健脑胶囊由五指毛桃等13味中药组成,具有补肾益脾、健脑生髓的功效,对治疗肾虚、脾虚引起的脑萎缩症具有较好的疗效。脑萎缩症病因复杂,起病缓慢,不易被发觉,病程长,进展缓慢,而且可能逐渐加重,影响患者的正常生活和工作,及早發现、积极适当地控制病情和进一步治疗具有重要意义。
1 仪器与试药
美国AngiLent公司1 200高效液相色谱仪;AgiLent ZORBAX SB-C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)。
补骨脂素对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号:110739-201508),乙腈、甲醇为色谱纯,水为高纯水,其他试剂均为分析纯。益智健脑胶囊及缺五指毛桃的阴性对照样品为广西强寿药业集团有限责任公司自制样品。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:AgiLent C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);流动相:乙腈-水(40∶60);流速为1.0 mL/min;检测波长为250 nm,柱温为室温,流速为1.0 mL·min-1。
在上述色谱条件下,补骨脂素与供试品中其他组分色谱峰达到基线分离,分离度良好,补骨脂素峰理论塔板数不低于4 000,补骨脂素及益智健脑胶囊供试样品色谱图如图1所示。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的补骨脂素对照品适量,用甲醇制成每1 mL含50 μg的对照品溶液,即得。
2.3 供试品溶液的制备
取本品适量,倾出内容物,研细,取约2.0 g,精密称定,置50 mL具塞锥形瓶中,加甲醇30 mL,超声处理(功率为400 W,频率为40 kHz)60 min,取出放冷,过滤,滤渣及滤器用甲醇适量洗涤3次,滤液及洗涤液置50 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用0.45 μm微孔滤膜过滤,即得供试品溶液。
2.4 线性关系考察
精密称取干燥至恒重的补骨脂素对照品12.53 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,制成对照品储备液。精密吸取对照品储备液1、2、4、6、8 mL分别置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,与储备液一起组成6个不同浓度的对照品溶液。精密吸取以上不同浓度对照品溶液各10 μL进样分析,以对照品溶液浓度(X,μg/mL)为横坐标,以峰面积积分值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,则补骨脂素的回归方程为y=1 860 509.68x+121 204.36(r=0.999 94)。结果表明,补骨脂素在25.06~250.60 μmg/mL浓度范围内时,进样量10 μL与补骨脂素峰面积呈良好的线性关系。
2.5 精密度实验 精密量取对照品溶液10 μL注入液相色谱仪,重复进样6次,结果补骨脂素峰面积RSD为1.02%,表明精密度较好(见表1)。
2.6 稳定性实验
取益智健脑胶囊同一供试品溶液(批号:150601)在室温下放置,分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样10 μL测定,结果供试品溶液补骨脂素峰面积RSD为0.87%,表明供试品溶液在24 h内基本稳定,峰面积没有在考察时间内呈现下降趋势(见表2)。
2.7 重复性实验
精密称取同一批益智健脑胶囊(批号:150601)细粉6份,按“供试品溶液的制备”项下方法制成供试品溶液,并在上述色谱条件下进样10 μL,测定补骨脂素峰面积,计算含量。结果供试品中补骨脂素含量的RSD值为1.02%,表明实验方法的重复性较好(见表3)。
2.8 回收率实验
分别精密称取9份已知含量的益智健脑胶囊(批号:150601)细粉约1.0 g,分别置于50 mL具塞锥形瓶中。精密称取补骨脂素对照品15.46 mg置50 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀。每个具塞锥形瓶分别准确加入对照品5 mL和甲醇45 mL,按“供试品溶液的制备”项下方法制成供试品液,在上述色谱条件下进样10 μL测定,结果平均回收率为98.97%,RSD=0.61%(见表4)。
2.9 干扰试验
取缺五指毛桃的阴性样品,按“供试品溶液的制备”项下的方法制成阴性样品溶液,在上述色谱条件下进样10 μL测定。试验结果表明,本品辅料在补骨脂素出峰时间无吸收,证明辅料对补骨脂素的测定无干扰,从而可保证本品测定方法的准确性。
2.10 样品测定
精密吸取供试品溶液10 μL分别注入液相色谱仪,在上述色谱条件下测定,每样平行测定5份,计算样品中补骨脂素的含量,结果10批样品的补骨脂素含量为1.483 1~1.534 6 mg/g(见表5)。
3 讨论
(1)供试品溶液制备的选择采用甲醇直接超声提取并稀释样品后进样,样品色谱峰中,在补骨脂素出峰时间的2倍以后未出现杂质峰,方法简便,分离效果理想。
(2)波长的选择。取补骨脂素对照品溶液,在200~400 nm范围内扫描,结果在波长250 nm处有最大吸收,故检测波长确定为250 nm。
(3)流动相选择。根据文献资料及自拟,选择了4个不同组成的流动相进行筛选试验,结果流动相[乙腈-水(40∶60)]峰形良好,被测成分分离度大于1.5,理论塔板数大于4 000。
(4)柱温、流速改变的影响。取对照品溶液进样,考察初始柱温在20℃、25℃、30℃,流速在0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min条件下,被测成分的分离度,结果柱温在25℃、流速为1.0 mL/min时分离度良好,能够保证补骨脂素检测的准确性。
(5)不同牌子或型号柱子的影响。采用3个不同厂家(“菲罗门”“安捷伦”“伊力特”)不同型号的柱子按相同色谱条件进样,结果被测成分分离度均良好,证明不同牌子或型号的柱子对本品检测影响不大。
(6)流动相比例的影响。对本品检测流动相[乙腈-水(40∶60)]的比例进行微调,进样检测,结果被测成分分离度均良好,证明本品检测使用的流动相较为适宜。
(7)破坏性试验的影响。采用强酸、强碱、高热、高湿、强光、氧化等方法对本品供試品液进行人为破坏,并进样检测,结果被测成分峰形良好,保留时间、分离度、板数均符合要求,证明本品检测方法准属性较强。
(8)重现性试验。在不同实验室,由不同分析人员分别对同一批样品进行检测,结果RSD值为1.02%,误差在规定范围内,证明本检测方法重现性良好。
4 小结
本文建立的高效液相色谱法,结果较为准确,且简便、快速、专属性强、可靠。
参 考 文 献
[1]现代中药学大辞典编委会.现代中药学大辞典[M].北京:人民卫生出版社,2001:371.
[2]董青松,欧彪,陈乾平,等.五指毛桃研究进展[J].广西医药,2006,28(6):950-952.
[3]赵丽萍,狄文武,冯锋,等.五指毛桃的化学成分[J].药学与临床研究,2008,16(1):5-7.
[责任编辑:陈泽琦]
【关键词】补骨脂素;益智健脑胶囊;高效液相色谱法;含量
【中图分类号】R286 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688(2016)10-0071-04
益智健脑胶囊为广西强寿药业集团有限责任公司在研新药品种,由五指毛桃、扶芳藤、牛大力、千斤拔、红参、熟地黄、肉苁蓉、山茱萸、当归、肉桂、三七、升麻、甘草等13味中药组成,具有补肾益脾、健脑生髓的功效,用于脾肾不足、精血亏虚所致健忘头昏、步态不稳、倦态食少、腰膝酸软等症。临床上用于主治脑萎缩(痴呆症)、中风后遗症等疾病。处方中的君药为五指毛桃。五指毛桃又名南芪、五爪龙、五指牛奶、土北芪,具有健脾利湿、益肺止咳、舒筋通络之功效[1],临床上主要用于脾虚浮肿、食少无力、肝炎、风湿痹痛、肺痨咳嗽等症。研究表明,五指毛桃含有补骨脂素、十六酸、佛手内酯、油酸等化合物[2-3],其中补骨脂素为其主要成分,可作为本品含量测定基准物进行研究,以保证新药益智健脑胶囊的产品质量。
脑萎缩症是老年人的常见病和多发病,常发生于50岁以上,病程可达数年至数十年,男性多于女性,脑萎缩有弥漫性脑萎缩(包括皮层萎缩、小脑萎缩及皮层、小脑、脑干萎缩)及局限性脑萎缩(多见于局限性脑器质性病变后如外伤、血管病、颅内局限性感染后等),其中弥漫性脑萎缩以痴呆、智能减退、记忆障碍、性格改变、行为障碍为主。有的伴有偏瘫和癫痫发作。局灶性脑萎缩以性格改变为主;小脑萎缩以语言障碍及形体的共济失调和震颤为主。
脑萎缩的原因是很多方面的。由于年老血液成分异常等因素,血液的黏稠度增高,使血流缓慢、血流量减少,致使正常的机能活动所需的能量减少;且年老微循环发生障碍,微循环网血液不畅,则记忆商可降低;老年人动脉含氧量降低,使脑细胞陷于相对缺氧,可引起脑细胞合成各种酶和神经传导质的量减少,均可导致脑萎缩。此外,遗传在本病的发生过程中也起了一定作用,衰老的过程、代谢障碍、内分泌机能减退等因素也与发病相关。
中医学认为,脑萎缩症属于先天禀赋不足,肾元亏虚或疾病迁延日久,气血不足,脑髓不充,筋脉失养所致;或因情志失调、气机不畅、气滞血瘀致使五脏功能失调使然,其中以肾元亏虚为本。肾受五脏六腑之精而藏之,且生髓并上注于脑,使髓海充养,髓海有余,则轻劲多力,自过其度。此外,本病与肝、脾二脏功能失调,亦有着十分密切的关系。因此,补肾健脾是治疗本病的根本,益智健脑胶囊由五指毛桃等13味中药组成,具有补肾益脾、健脑生髓的功效,对治疗肾虚、脾虚引起的脑萎缩症具有较好的疗效。脑萎缩症病因复杂,起病缓慢,不易被发觉,病程长,进展缓慢,而且可能逐渐加重,影响患者的正常生活和工作,及早發现、积极适当地控制病情和进一步治疗具有重要意义。
1 仪器与试药
美国AngiLent公司1 200高效液相色谱仪;AgiLent ZORBAX SB-C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)。
补骨脂素对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号:110739-201508),乙腈、甲醇为色谱纯,水为高纯水,其他试剂均为分析纯。益智健脑胶囊及缺五指毛桃的阴性对照样品为广西强寿药业集团有限责任公司自制样品。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:AgiLent C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);流动相:乙腈-水(40∶60);流速为1.0 mL/min;检测波长为250 nm,柱温为室温,流速为1.0 mL·min-1。
在上述色谱条件下,补骨脂素与供试品中其他组分色谱峰达到基线分离,分离度良好,补骨脂素峰理论塔板数不低于4 000,补骨脂素及益智健脑胶囊供试样品色谱图如图1所示。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的补骨脂素对照品适量,用甲醇制成每1 mL含50 μg的对照品溶液,即得。
2.3 供试品溶液的制备
取本品适量,倾出内容物,研细,取约2.0 g,精密称定,置50 mL具塞锥形瓶中,加甲醇30 mL,超声处理(功率为400 W,频率为40 kHz)60 min,取出放冷,过滤,滤渣及滤器用甲醇适量洗涤3次,滤液及洗涤液置50 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用0.45 μm微孔滤膜过滤,即得供试品溶液。
2.4 线性关系考察
精密称取干燥至恒重的补骨脂素对照品12.53 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,制成对照品储备液。精密吸取对照品储备液1、2、4、6、8 mL分别置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,与储备液一起组成6个不同浓度的对照品溶液。精密吸取以上不同浓度对照品溶液各10 μL进样分析,以对照品溶液浓度(X,μg/mL)为横坐标,以峰面积积分值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,则补骨脂素的回归方程为y=1 860 509.68x+121 204.36(r=0.999 94)。结果表明,补骨脂素在25.06~250.60 μmg/mL浓度范围内时,进样量10 μL与补骨脂素峰面积呈良好的线性关系。
2.5 精密度实验 精密量取对照品溶液10 μL注入液相色谱仪,重复进样6次,结果补骨脂素峰面积RSD为1.02%,表明精密度较好(见表1)。
2.6 稳定性实验
取益智健脑胶囊同一供试品溶液(批号:150601)在室温下放置,分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样10 μL测定,结果供试品溶液补骨脂素峰面积RSD为0.87%,表明供试品溶液在24 h内基本稳定,峰面积没有在考察时间内呈现下降趋势(见表2)。
2.7 重复性实验
精密称取同一批益智健脑胶囊(批号:150601)细粉6份,按“供试品溶液的制备”项下方法制成供试品溶液,并在上述色谱条件下进样10 μL,测定补骨脂素峰面积,计算含量。结果供试品中补骨脂素含量的RSD值为1.02%,表明实验方法的重复性较好(见表3)。
2.8 回收率实验
分别精密称取9份已知含量的益智健脑胶囊(批号:150601)细粉约1.0 g,分别置于50 mL具塞锥形瓶中。精密称取补骨脂素对照品15.46 mg置50 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀。每个具塞锥形瓶分别准确加入对照品5 mL和甲醇45 mL,按“供试品溶液的制备”项下方法制成供试品液,在上述色谱条件下进样10 μL测定,结果平均回收率为98.97%,RSD=0.61%(见表4)。
2.9 干扰试验
取缺五指毛桃的阴性样品,按“供试品溶液的制备”项下的方法制成阴性样品溶液,在上述色谱条件下进样10 μL测定。试验结果表明,本品辅料在补骨脂素出峰时间无吸收,证明辅料对补骨脂素的测定无干扰,从而可保证本品测定方法的准确性。
2.10 样品测定
精密吸取供试品溶液10 μL分别注入液相色谱仪,在上述色谱条件下测定,每样平行测定5份,计算样品中补骨脂素的含量,结果10批样品的补骨脂素含量为1.483 1~1.534 6 mg/g(见表5)。
3 讨论
(1)供试品溶液制备的选择采用甲醇直接超声提取并稀释样品后进样,样品色谱峰中,在补骨脂素出峰时间的2倍以后未出现杂质峰,方法简便,分离效果理想。
(2)波长的选择。取补骨脂素对照品溶液,在200~400 nm范围内扫描,结果在波长250 nm处有最大吸收,故检测波长确定为250 nm。
(3)流动相选择。根据文献资料及自拟,选择了4个不同组成的流动相进行筛选试验,结果流动相[乙腈-水(40∶60)]峰形良好,被测成分分离度大于1.5,理论塔板数大于4 000。
(4)柱温、流速改变的影响。取对照品溶液进样,考察初始柱温在20℃、25℃、30℃,流速在0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min条件下,被测成分的分离度,结果柱温在25℃、流速为1.0 mL/min时分离度良好,能够保证补骨脂素检测的准确性。
(5)不同牌子或型号柱子的影响。采用3个不同厂家(“菲罗门”“安捷伦”“伊力特”)不同型号的柱子按相同色谱条件进样,结果被测成分分离度均良好,证明不同牌子或型号的柱子对本品检测影响不大。
(6)流动相比例的影响。对本品检测流动相[乙腈-水(40∶60)]的比例进行微调,进样检测,结果被测成分分离度均良好,证明本品检测使用的流动相较为适宜。
(7)破坏性试验的影响。采用强酸、强碱、高热、高湿、强光、氧化等方法对本品供試品液进行人为破坏,并进样检测,结果被测成分峰形良好,保留时间、分离度、板数均符合要求,证明本品检测方法准属性较强。
(8)重现性试验。在不同实验室,由不同分析人员分别对同一批样品进行检测,结果RSD值为1.02%,误差在规定范围内,证明本检测方法重现性良好。
4 小结
本文建立的高效液相色谱法,结果较为准确,且简便、快速、专属性强、可靠。
参 考 文 献
[1]现代中药学大辞典编委会.现代中药学大辞典[M].北京:人民卫生出版社,2001:371.
[2]董青松,欧彪,陈乾平,等.五指毛桃研究进展[J].广西医药,2006,28(6):950-952.
[3]赵丽萍,狄文武,冯锋,等.五指毛桃的化学成分[J].药学与临床研究,2008,16(1):5-7.
[责任编辑:陈泽琦]