【摘 要】
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目的建立一种快速、灵敏、特异定量检测人外周血单个核细胞(PBMC)表达TNF-α mRNA的方法.方法根据Gene Bank中TNF-α mRNA序列和MGB探针荧光定量分析原理,设计合成特异的引物
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目的建立一种快速、灵敏、特异定量检测人外周血单个核细胞(PBMC)表达TNF-α mRNA的方法.方法根据Gene Bank中TNF-α mRNA序列和MGB探针荧光定量分析原理,设计合成特异的引物和探针,优化实验条件,建立定量检测人TNF-α mRNA的实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并对10名健康体检者PBMC PHA刺激前后进行TNF-α表达检测.结果本法灵敏度为103拷贝/毫升、线性检测范围达6个数量级(103～109拷贝/毫升);特异性好,PCR产物电泳后无非特异性条带产生,非目的扩增产物用本法进行检测,均无荧光信号响应;以Ct值计算变异系数(CV值),批内批间CV值均小于5%;10名健康体检者PBMC PHA刺激前后TNF-α mRNA的平均含量分别为10 4.15±0.49 和105.19±0.43拷贝/毫升.结论Taqman-MGB实时荧光RT-PCR定量检测人TNF-α mRNA表达水平,结果快速、准确、特异、灵敏,具有临床推广价值.
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