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摘 要：对蓖麻根际菌株LX6的抗菌活性进行了测定。结果表明，该菌株对多种植物病原真菌具有明显的抑制作用，表现出广谱抗菌活性。其中对三七根腐病菌（Cylindrocarpon destruans）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、玉米弯孢病菌（Curvularia lunata）和禾谷镰刀病菌（Fusarium graminearum ）的抑菌效果均达50%以上。通过对LX6菌株的形态特征、染色反应、培养性状、生理生化特征试验以及16S rDNA鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌。
关键词：蓖麻根际菌株LX6；抑菌活性；分子鉴定；枯草芽孢杆菌
中图分类号：S154.38+1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）12-0078-03
Determination of Antibacterial Activity and Molecular Identification
of Antagonistic Bacterium LX6 from Castor-oil Rhizosphere
Chi YuCheng1*， Xu ManLin1*， Xie HongFeng1， Yang WeiQiang1， Wang BaoLiang2， Cao TieHua3
（1.Shandong Peanut Research Institute， Qingdao 266100， China；
2. Agricultural Bureau of Jiaonan City， Jiaonan 266400， China；
3.Jilin Academy of Agricultural Sciences， Changchun 130033， China）
Abstract The antagonistic activity of strain LX6 from castor-oil rhizosphere was determined in this paper. The results showed that LX6 strain had obvious antagonistic activity against many plant pathogenic fungus， especially to Cylindrocarpon destruans， Fusarium oxysporum， Curvularia Lunata and Fusarium graminearum， the antibacterial rate could be over 50%. According to the tests on morphological features， staining reaction， culture traits， physiological and biochemical characteristic and 16S rDNA， it was identified as Bacillus subtilis.
Key words Strain LX6 from castor-oil rhizospher； Antagonistic activity；Molecular identification； Bacillus subtilis
蓖麻种植在全世界30余个国家已经达到了工业化规模。在印度、中国、巴西、前苏联、泰国、埃塞俄比亚和菲律宾等国的蓖麻产量约占全世界蓖麻总产量的近88%。历史上，巴西、中国、印度是主要的生产国。蓖麻提取物作为杀虫剂已有广泛的应用[1，2]，但对其根际微生物的研究还鲜有报道。
芽孢杆菌是生防细菌中表现较为突出的一种，被引入植物生物防治领域并表现出良好的发展趋势，其以控制病害发生，促进植株生长，提高作物产量以及易于生产和运输等方面表现出特有的优势[3～6]。笔者从蓖麻根际土壤中筛选到一株对多种植物病原菌有良好抑制作用的生防细菌LX6，此菌株表现出了广谱的抗菌活性。根据形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，鉴定其为枯草芽孢杆菌。
1 材料与方法
11 供试菌株及病原物
供试拮抗菌LX6和供试病原物（表1）均由本实验室分离保存。
12 培养基
LB培养基（LB）和马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）分别用于LX6和真菌的固体培养，相应的培养液用于两类微生物的液体培养，对峙培养法均在PDA培养基上进行。
13 试验方法
131 平板对峙培养法测定对蓖麻枯萎病菌的抑制作用 采用平板对峙培养法[7]，在PDA平板中间接入培养3～4天的植物病原真菌，d=5 mm，28℃恒温培养。1～2天后，挑取已经在28℃下培养3～4天的芽孢杆菌菌株菌体分别接种在距离真菌菌落中央2 cm处，使成为一个约d=2 mm的菌落，继续培养，定期检查抑制效果，测量菌落直径，计算抑制率。
抑制率（%）=（对照真菌的生长直径-拮抗菌作用后的真菌生长直径）/对照真菌的生长直径×100。
132 细菌鉴定方法 参照《伯杰氏细菌鉴定手册》对生防菌进行生理生化鑒定：将纯化好的菌株接种到LB培养基上，28℃培养，24 h后取纯化好的菌株涂片，进行革兰氏染色及运动力检测。生理生化测定包括氧化酶反应，VP试验，淀粉水解，明胶液化，吲哚、葡萄糖的利用。
菌株16S rDNA鉴定：提取生防菌菌株的DNA，其提取方法主要参照TIANGEN TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒说明书进行；PCR扩增，参照TaKaRa公司的16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒说明书进行PCR扩增。扩增引物为细菌通用引物，序列如下：正向引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物 1541R：5′-AAGGAGGTGATCCACCC-3′。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳分析特性，染色后置于3UVTMTransilluminator（UVP，USA）下，检测扩增结果；16S rDNA序列测定与分析，所得扩增片段16S rDNA测序由金斯瑞（南京）有限公司进行序列测定。通过NCBI网站上的BLAST程序将测定的序列与GenBank中的序列比较，然后从GenBank中获得和试验菌株序列相近种、属的16S rDNA序列。2 结果与分析 21 LX6对植物病原真菌的拮抗作用
表1结果显示，生防菌株LX6对供试的12种病原菌都有不同程度的抑制作用，其中，对三七根腐病菌、棉花枯萎病菌、玉米弯孢病菌、禾谷镰刀病菌均有较强的抑制效果（图1），抑菌率均达50%以上。由此可见，LX6对植物真菌具有广谱的抗菌效果。
首先提取生防细菌DNA，以该DNA为模板，16S rDNA通用引物为引物，对16S rDNA片段进行扩增。PCR产物电泳结果显示，在分子量大小为 1 400 bp左右得到一条特异性好的条带，与预期结果一致。扩增的片段进行序列测定，将测序的结果输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对，与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）同源性最高，达到99%，初步鉴定为枯草芽孢杆菌，结合生理生化特性做进一步鉴定。
23 LX6菌株的生理生化测定
通过表面形态观察，该菌为不规则形，白色，表面膜状起皱，革兰氏染色阳性，结合其他生理生化指标测定（表2），可以进一步判定菌株LX6为枯草芽孢杆菌。
3 结论与讨论
芽孢杆菌是一类在土壤和植物根际广泛存在的有益微生物，在植物病害的生防控制中显现出了非常突出的应用价值，同时这类细菌具有良好的抗逆性， 对人畜无害， 不污染环境，且产芽孢易于生产和储存，因而备受植病生防研究者的青睐。目前，已有多种菌株被商品化并广泛用于镰刀枯萎病、立枯病和曲霉病等多种植物病害的防治[8]。笔者从蓖麻根际筛选出一株生防菌LX6，经鉴定为枯草芽孢杆菌，对供试12种植物病原真菌均有较明显的抑制作用，尤其对三七根腐病菌、棉花枯萎病菌、玉米弯孢病菌、禾谷镰刀病菌有较强的抑制效果，抑菌率均达50%以上，显现出其作为生防菌的显著优势和良好的应用前景。
枯草芽孢杆菌是一类能产生多种抗菌物质、具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力的杆状细菌。目前已从不同来源的菌株中分离到多肽类、脂肽类、细菌素和蛋白质等多种类型的抗菌物质， 这些抗菌物质大多对病原真菌表现出强烈的拮抗活性[9～12]。本研究分离的一株枯草芽孢杆菌表现出突出的抗菌活性，值得深入研究其作用机理。在今后的工作中将尝试着分离纯化LX6的抑菌物质，以期为研究其作用机理、大量获得抗菌物质打下基础。另一方面也可借助分子生物学手段，根据GeneBank中公布的Bacillus subtilis的全序列，直接设计引物克隆抗菌蛋白基因并进行表达，以期大量获得抗菌蛋白基因，并为下一步构建高效生防菌株打下基础。参 考 文 献：
[1] 赵建新，张树怀，佘国珍 蓖麻毒素粗提物杀虫作用的研究[J]内蒙古农业大学学报，2001，22（4）：78-80
[2] 徐齐云，胡美英，刘萱清，等蓖麻提取物对蔬菜害虫的杀虫活性研究[J]长江蔬菜， 2006，11：35-36
[3] Schmidt C S， Agostini F， Leifert C， et al Influence of soil temperature and matric potential on sugar beet seedling colonization and suppression of pythium damping-off by the antagonistic Bacteria pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis[J] Phytopathology，2004，94（4）：351-363
[4] Cazorla F M， Romero D， Pérez-García A， et al Isolation and characterization of antagonistic Bacillus subtilis strains from the avocado rhizoplane displaying biocontrol activity[J] J Appl Microbiol， 2007，103（5）：1950-1959
[5] Chen H， Xiao X， Wang J， et al Antagonistic effects of volatiles generated by Bacillus subtilis on spore germination and hyphal growth of the plant pathogen， Botrytis cinerea[J] Biotechnol Lett，2008，30（5）：919-923
[6] Lee N K， Yeo I C， Park J W， et al Isolation and characterization of a novel analyte from Bacillus subtilis SC-8 antagonistic to Bacillus cereus[J]JBiosciBioeng，2010， 110（3）：298-303
[7] 方中达植病研究法（第3版）[M]北京：中国农业出版社，1998
[8] 陈中义，张 杰，黄大昉 植物病害生防芽孢杆菌抗菌机制与遗传改良研究[J] 植物病理学报， 2003，33（2）：97-103
[9] Romero D， de Vicente A， Olmos J L， et al Effect of lipopeptides of antagonistic strains of Bacillus subtilis on the morphology and ultrastructure of the cucurbit fungal pathogen Podosphaera fusca[J] J Appl Microbiol， 2007，103（4）：969-976
[10] 连玲丽，谢荔岩，郑璐平，等 拮抗菌SB1的鉴定及其抗菌物质的分析[J] 微生物学通报，2010，37（7）：986-991
[11] Yeo I C， Lee N K， Cha C J，et al Narrow antagonistic activity of antimicrobial peptide from Bacillus subtilis SCK-2 against Bacillus cereus[J] J Biosci Bioeng，2011，112（4）：338-344
[12] 張晓云，李宝庆，郭庆港，等 生防枯草芽孢杆菌CAB-1抑菌蛋白产生条件及其稳定性研究[J]中国农业科技导报，2011，13（2）：59-67 山 东 农 业 科 学 2012，44（12）：81～84
关键词：蓖麻根际菌株LX6；抑菌活性；分子鉴定；枯草芽孢杆菌
中图分类号：S154.38+1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）12-0078-03
Determination of Antibacterial Activity and Molecular Identification
of Antagonistic Bacterium LX6 from Castor-oil Rhizosphere
Chi YuCheng1*， Xu ManLin1*， Xie HongFeng1， Yang WeiQiang1， Wang BaoLiang2， Cao TieHua3
（1.Shandong Peanut Research Institute， Qingdao 266100， China；
2. Agricultural Bureau of Jiaonan City， Jiaonan 266400， China；
3.Jilin Academy of Agricultural Sciences， Changchun 130033， China）
Abstract The antagonistic activity of strain LX6 from castor-oil rhizosphere was determined in this paper. The results showed that LX6 strain had obvious antagonistic activity against many plant pathogenic fungus， especially to Cylindrocarpon destruans， Fusarium oxysporum， Curvularia Lunata and Fusarium graminearum， the antibacterial rate could be over 50%. According to the tests on morphological features， staining reaction， culture traits， physiological and biochemical characteristic and 16S rDNA， it was identified as Bacillus subtilis.
Key words Strain LX6 from castor-oil rhizospher； Antagonistic activity；Molecular identification； Bacillus subtilis
蓖麻种植在全世界30余个国家已经达到了工业化规模。在印度、中国、巴西、前苏联、泰国、埃塞俄比亚和菲律宾等国的蓖麻产量约占全世界蓖麻总产量的近88%。历史上，巴西、中国、印度是主要的生产国。蓖麻提取物作为杀虫剂已有广泛的应用[1，2]，但对其根际微生物的研究还鲜有报道。
芽孢杆菌是生防细菌中表现较为突出的一种，被引入植物生物防治领域并表现出良好的发展趋势，其以控制病害发生，促进植株生长，提高作物产量以及易于生产和运输等方面表现出特有的优势[3～6]。笔者从蓖麻根际土壤中筛选到一株对多种植物病原菌有良好抑制作用的生防细菌LX6，此菌株表现出了广谱的抗菌活性。根据形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，鉴定其为枯草芽孢杆菌。
1 材料与方法
11 供试菌株及病原物
供试拮抗菌LX6和供试病原物（表1）均由本实验室分离保存。
12 培养基
LB培养基（LB）和马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）分别用于LX6和真菌的固体培养，相应的培养液用于两类微生物的液体培养，对峙培养法均在PDA培养基上进行。
13 试验方法
131 平板对峙培养法测定对蓖麻枯萎病菌的抑制作用 采用平板对峙培养法[7]，在PDA平板中间接入培养3～4天的植物病原真菌，d=5 mm，28℃恒温培养。1～2天后，挑取已经在28℃下培养3～4天的芽孢杆菌菌株菌体分别接种在距离真菌菌落中央2 cm处，使成为一个约d=2 mm的菌落，继续培养，定期检查抑制效果，测量菌落直径，计算抑制率。
抑制率（%）=（对照真菌的生长直径-拮抗菌作用后的真菌生长直径）/对照真菌的生长直径×100。
132 细菌鉴定方法 参照《伯杰氏细菌鉴定手册》对生防菌进行生理生化鑒定：将纯化好的菌株接种到LB培养基上，28℃培养，24 h后取纯化好的菌株涂片，进行革兰氏染色及运动力检测。生理生化测定包括氧化酶反应，VP试验，淀粉水解，明胶液化，吲哚、葡萄糖的利用。
菌株16S rDNA鉴定：提取生防菌菌株的DNA，其提取方法主要参照TIANGEN TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒说明书进行；PCR扩增，参照TaKaRa公司的16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒说明书进行PCR扩增。扩增引物为细菌通用引物，序列如下：正向引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物 1541R：5′-AAGGAGGTGATCCACCC-3′。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳分析特性，染色后置于3UVTMTransilluminator（UVP，USA）下，检测扩增结果；16S rDNA序列测定与分析，所得扩增片段16S rDNA测序由金斯瑞（南京）有限公司进行序列测定。通过NCBI网站上的BLAST程序将测定的序列与GenBank中的序列比较，然后从GenBank中获得和试验菌株序列相近种、属的16S rDNA序列。2 结果与分析 21 LX6对植物病原真菌的拮抗作用
表1结果显示，生防菌株LX6对供试的12种病原菌都有不同程度的抑制作用，其中，对三七根腐病菌、棉花枯萎病菌、玉米弯孢病菌、禾谷镰刀病菌均有较强的抑制效果（图1），抑菌率均达50%以上。由此可见，LX6对植物真菌具有广谱的抗菌效果。
首先提取生防细菌DNA，以该DNA为模板，16S rDNA通用引物为引物，对16S rDNA片段进行扩增。PCR产物电泳结果显示，在分子量大小为 1 400 bp左右得到一条特异性好的条带，与预期结果一致。扩增的片段进行序列测定，将测序的结果输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对，与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）同源性最高，达到99%，初步鉴定为枯草芽孢杆菌，结合生理生化特性做进一步鉴定。
23 LX6菌株的生理生化测定
通过表面形态观察，该菌为不规则形，白色，表面膜状起皱，革兰氏染色阳性，结合其他生理生化指标测定（表2），可以进一步判定菌株LX6为枯草芽孢杆菌。
3 结论与讨论
芽孢杆菌是一类在土壤和植物根际广泛存在的有益微生物，在植物病害的生防控制中显现出了非常突出的应用价值，同时这类细菌具有良好的抗逆性， 对人畜无害， 不污染环境，且产芽孢易于生产和储存，因而备受植病生防研究者的青睐。目前，已有多种菌株被商品化并广泛用于镰刀枯萎病、立枯病和曲霉病等多种植物病害的防治[8]。笔者从蓖麻根际筛选出一株生防菌LX6，经鉴定为枯草芽孢杆菌，对供试12种植物病原真菌均有较明显的抑制作用，尤其对三七根腐病菌、棉花枯萎病菌、玉米弯孢病菌、禾谷镰刀病菌有较强的抑制效果，抑菌率均达50%以上，显现出其作为生防菌的显著优势和良好的应用前景。
枯草芽孢杆菌是一类能产生多种抗菌物质、具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力的杆状细菌。目前已从不同来源的菌株中分离到多肽类、脂肽类、细菌素和蛋白质等多种类型的抗菌物质， 这些抗菌物质大多对病原真菌表现出强烈的拮抗活性[9～12]。本研究分离的一株枯草芽孢杆菌表现出突出的抗菌活性，值得深入研究其作用机理。在今后的工作中将尝试着分离纯化LX6的抑菌物质，以期为研究其作用机理、大量获得抗菌物质打下基础。另一方面也可借助分子生物学手段，根据GeneBank中公布的Bacillus subtilis的全序列，直接设计引物克隆抗菌蛋白基因并进行表达，以期大量获得抗菌蛋白基因，并为下一步构建高效生防菌株打下基础。参 考 文 献：
[1] 赵建新，张树怀，佘国珍 蓖麻毒素粗提物杀虫作用的研究[J]内蒙古农业大学学报，2001，22（4）：78-80
[2] 徐齐云，胡美英，刘萱清，等蓖麻提取物对蔬菜害虫的杀虫活性研究[J]长江蔬菜， 2006，11：35-36
[3] Schmidt C S， Agostini F， Leifert C， et al Influence of soil temperature and matric potential on sugar beet seedling colonization and suppression of pythium damping-off by the antagonistic Bacteria pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis[J] Phytopathology，2004，94（4）：351-363
[4] Cazorla F M， Romero D， Pérez-García A， et al Isolation and characterization of antagonistic Bacillus subtilis strains from the avocado rhizoplane displaying biocontrol activity[J] J Appl Microbiol， 2007，103（5）：1950-1959
[5] Chen H， Xiao X， Wang J， et al Antagonistic effects of volatiles generated by Bacillus subtilis on spore germination and hyphal growth of the plant pathogen， Botrytis cinerea[J] Biotechnol Lett，2008，30（5）：919-923
[6] Lee N K， Yeo I C， Park J W， et al Isolation and characterization of a novel analyte from Bacillus subtilis SC-8 antagonistic to Bacillus cereus[J]JBiosciBioeng，2010， 110（3）：298-303
[7] 方中达植病研究法（第3版）[M]北京：中国农业出版社，1998
[8] 陈中义，张 杰，黄大昉 植物病害生防芽孢杆菌抗菌机制与遗传改良研究[J] 植物病理学报， 2003，33（2）：97-103
[9] Romero D， de Vicente A， Olmos J L， et al Effect of lipopeptides of antagonistic strains of Bacillus subtilis on the morphology and ultrastructure of the cucurbit fungal pathogen Podosphaera fusca[J] J Appl Microbiol， 2007，103（4）：969-976
[10] 连玲丽，谢荔岩，郑璐平，等 拮抗菌SB1的鉴定及其抗菌物质的分析[J] 微生物学通报，2010，37（7）：986-991
[11] Yeo I C， Lee N K， Cha C J，et al Narrow antagonistic activity of antimicrobial peptide from Bacillus subtilis SCK-2 against Bacillus cereus[J] J Biosci Bioeng，2011，112（4）：338-344
[12] 張晓云，李宝庆，郭庆港，等 生防枯草芽孢杆菌CAB-1抑菌蛋白产生条件及其稳定性研究[J]中国农业科技导报，2011，13（2）：59-67 山 东 农 业 科 学 2012，44（12）：81～84