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摘要：目的建立丙酸睾丸酮（testosterone propionate，TP）及高脂饲料诱导的大鼠多囊卵巢综合征（polycyst ic ov ar ian syndrome，PCOS）胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）动物模型，并探讨其胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）特征。方法将21 日龄雌性SD大鼠随机分为PCOS 组（10只）和对照组（10只），PCOS 组每日皮下注射丙酸睾丸酮的油剂连续8周；对照组每日皮下注射同剂量大豆油剂，连续8周。观察卵巢形态学改变，测定血中性激素、空腹血糖（FPG）和空腹胰岛素（FIN S）浓度，并计算胰岛素抵抗指数（HOMA1-IR）。结果模型组卵巢见多个呈囊性扩张的卵泡黄体细胞少见，颗粒细胞层减少。与对照组比较，模型组体重增加，卵巢重量及卵巢平均体积增加（P<0.05），血清睾酮（T），LH、LH/FSH、FINS 和HOMA-IR 均显著增高（P<0.05）。结论丙酸睾丸酮合并高脂饮食可成功诱导大鼠PCOS胰岛素抵抗模型。
关键词：多囊卵巢综合征；动物模型；胰岛素抵抗
中图分类号：R965.1文献标志码：A文章编号：1007-2349（2014）09-0069-03
多囊卵巢综合征是育龄期妇女常见的生殖内分泌及代谢紊乱性疾病，其病因不清，具体发病机制不明，同时至今没有最佳治疗方案，因此建立一种理想的PCOS动物模型非常重要，由于大鼠有规律的动情周期，且周期较短（4-5 d），容易在较短时间观察到更多的生殖周期，因而成为较理想PCOS造模动物[1]。现代研究认为高雄激素血症和胰岛素抵抗是PCOS的主要内分泌特征，二者相互促进，恶性循环，参与了PCOS的病理过程，为进一步探索治疗PCOS的方案，本文采用丙酸睾丸酮及高脂饲料诱导雌性SD大鼠PCOS 动物模型，并分析其胰岛素抵抗（insulinresistance，IR）特征，旨在寻找一种符合人IR 特征的PCOS 研究模型。
1实验资料与方法
1.1实验动物及动物模型构建选取21 日龄的SD雌性大鼠，随机分成模型组与对照组，每组各10 只。 模型组大鼠断奶后于第22 日龄起喂高脂饲料喂养（成分为54%的普通颗粒饲料、17%猪油、15%糖、9%酪蛋白、1%矿物质、1%维生素、3%麦芽糊精，由广东省实验动物中心加工完成），并每天皮下注射含丙酸睾丸酮的油剂（将1 g丙酸睾丸粉末溶解于100 mL注射用无菌大豆油中，配成10 mg/mL的油剂），以1 mg/100 g体重剂量注射，连续8周。对照组每天给予普通饲料喂养，并每天皮下注射注射等剂量的大豆油剂，连续8周。
1.2试剂丙酸睾丸酮（美国sigma公司）；卵泡刺激素放免试剂盒（北京北方生物技术研究所）；雌二醇放免试剂盒（北京北方生物技术研究所）；睾酮放免试剂盒（北京北方生物技术研究所）；胰岛素放免试剂盒（北京北方生物技术研究所）；促黄体生成素ELISA试剂盒（美国R&D公司）；促卵泡生成素ELISA试剂盒（美国R&D公司）；罗氏活力型血糖仪（德国罗氏诊断有限公司）。
1.3性激素检测口服糖耐量检测结束后第3天，18：00开始禁食，次日晨以10%水合氯醛（6 mL/kg）腹腔注射麻醉后，眶静脉采血4～7 mL，离心后收集血清，-20℃冻存，以放射免疫法检测睾酮和雌二醇，ELISA法检测FSH和LH。
1.4口服糖耐量（OGTT）试验皮下注射8周后，18：00开始禁食，次日晨8：00，尾静脉采血1～2 mL，3000 r/min离心10 min收集血清，-20℃冻存，以放射免疫法测空腹胰岛素。利用罗氏血糖仪测血糖值。HOMA-IR=FINS*FPG/22.5。
1.5卵巢形态学检测大鼠10% 水合氯醛麻醉后处死。切取部分卵巢组织，常规石蜡包埋、切片以及HE 染色。
1.6统计学处理使用SPSS13.0软件，数据以均数±标准差（x±s）表示，其中HOMA-IR呈偏态分布，故取其自然对数（ln）后用均数±标准差（x±s）表示，进行两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
3讨论
目前，国内外针对PCOS已建立了多种造模方法，有雄激素造模法、雌激素造模法、孕激素联合HCG造模法、胰岛素联合HCG造模法、芳香化酶抑制剂造模法等，但这些造模方法都还不成熟完善，无法完全模拟临床上PCOS患者发病，研究认为临床上大部分PCOS患者尤其是具有IR和高胰岛素血症者，常伴有体质量的增加和脂肪代谢的紊乱[2-4]。
高脂饮食可能是女性多囊卵巢的发病诱因之一[5]，高脂饮食可诱导出IR，其机制可涉及胰岛素信号转导的多个环节，如胰岛素受体、胰岛素受体底物蛋白表达及磷酸化的减少，PI3K及PKB活性的改变等[6]，但一些研究认为单独应用高脂饲料构建的PCOS 模型在性激素及卵巢形态改变方面不典型，因此需与激素诱导法联合应用。丙酸睾丸酮是目前常用来PCOS造模的药物，桂文武等发现丙酸睾酮造模法，可使卵巢均呈多囊改变，睾酮、空腹血糖和空腹胰岛素水平升高[7]，为了使模型尽量符合人类PCOS的特点，本研究通过丙酸睾丸酮结合高脂饮食造模旨在更能使模型体现PCOS的高雄及高胰岛素的特征。
结果显示，丙酸睾丸酮结合高脂饮食造模组大鼠的卵巢出现了多囊卵巢的病理改变，表现为卵巢表面苍白，卵巢内黄体少见，卵泡多呈囊性扩张，除了卵巢形态学的改变，丙酸睾丸酮结合高脂饮食模型组大鼠具备PCOS典型的生理病理特征雄激素水平升高、LH/FSH比值升高，空腹胰岛素升高及其HOMA-IR显著高于对照组。说明此动物模型在卵巢形态学
和性激素分泌异常方面与PCOS患者类似，在糖代谢方面也与PCOS患者相似，因此，丙酸睾丸酮结合高脂饮食诱导的PCOS动物模型对于研究PCOS合并胰岛素抵抗的发生机制为一种理想的动物模型。参考文献： [1]Singh KB.Persistent estrus rat models o f polycystic ovary disease：an update[J].Fertility and Sterility，2005，84（S2）：1228-1234.
[2]Gambineri A，Pelusi C，Vicennati V，et al.Obesity and the polycystic ovary syndrome[J].Int J Obes Relat Metab Disord，2002，26（7）：883-896.
[3]Pasquali R，Gambineri A.Metabolic effects of obesity on reproduction[J].Reprod Biomed Online，2006，12（5）：542-551.
[4]Olszanecka-GlinianowiczM，BanasM，Zahorska-Markiewicz Z，et al.Insulin resistance and serum concentrations of ovarian and adrenal androgen in obese women without additional disease and with polycystic ovary syndrome[J].Endokrynol Pol，2005，56（6）：921-926.
[5]倪倩倩，朱梦娇，姚根宏，等.高脂肪饮食诱导多囊卵巢综合征表型改变的实验研究[J]，医学研究生学报，2014，27（2）：116-119.
[6]Youngren JF，Paik J，Barnard RJ.Impaired insulin-receptor autophosphorylation is an early defect in fat-fed，insulin resistant rats[J].J Appl Physiol，2001，91（5）：2240-2247.
[7]桂文武，陈静，丘彦，等.类多囊卵巢综合征大鼠模型的比较研究[J].中国比较医学杂志，2006，16（6）：330-332.
（收稿日期：2014-07-01）
关键词：多囊卵巢综合征；动物模型；胰岛素抵抗
中图分类号：R965.1文献标志码：A文章编号：1007-2349（2014）09-0069-03
多囊卵巢综合征是育龄期妇女常见的生殖内分泌及代谢紊乱性疾病，其病因不清，具体发病机制不明，同时至今没有最佳治疗方案，因此建立一种理想的PCOS动物模型非常重要，由于大鼠有规律的动情周期，且周期较短（4-5 d），容易在较短时间观察到更多的生殖周期，因而成为较理想PCOS造模动物[1]。现代研究认为高雄激素血症和胰岛素抵抗是PCOS的主要内分泌特征，二者相互促进，恶性循环，参与了PCOS的病理过程，为进一步探索治疗PCOS的方案，本文采用丙酸睾丸酮及高脂饲料诱导雌性SD大鼠PCOS 动物模型，并分析其胰岛素抵抗（insulinresistance，IR）特征，旨在寻找一种符合人IR 特征的PCOS 研究模型。
1实验资料与方法
1.1实验动物及动物模型构建选取21 日龄的SD雌性大鼠，随机分成模型组与对照组，每组各10 只。 模型组大鼠断奶后于第22 日龄起喂高脂饲料喂养（成分为54%的普通颗粒饲料、17%猪油、15%糖、9%酪蛋白、1%矿物质、1%维生素、3%麦芽糊精，由广东省实验动物中心加工完成），并每天皮下注射含丙酸睾丸酮的油剂（将1 g丙酸睾丸粉末溶解于100 mL注射用无菌大豆油中，配成10 mg/mL的油剂），以1 mg/100 g体重剂量注射，连续8周。对照组每天给予普通饲料喂养，并每天皮下注射注射等剂量的大豆油剂，连续8周。
1.2试剂丙酸睾丸酮（美国sigma公司）；卵泡刺激素放免试剂盒（北京北方生物技术研究所）；雌二醇放免试剂盒（北京北方生物技术研究所）；睾酮放免试剂盒（北京北方生物技术研究所）；胰岛素放免试剂盒（北京北方生物技术研究所）；促黄体生成素ELISA试剂盒（美国R&D公司）；促卵泡生成素ELISA试剂盒（美国R&D公司）；罗氏活力型血糖仪（德国罗氏诊断有限公司）。
1.3性激素检测口服糖耐量检测结束后第3天，18：00开始禁食，次日晨以10%水合氯醛（6 mL/kg）腹腔注射麻醉后，眶静脉采血4～7 mL，离心后收集血清，-20℃冻存，以放射免疫法检测睾酮和雌二醇，ELISA法检测FSH和LH。
1.4口服糖耐量（OGTT）试验皮下注射8周后，18：00开始禁食，次日晨8：00，尾静脉采血1～2 mL，3000 r/min离心10 min收集血清，-20℃冻存，以放射免疫法测空腹胰岛素。利用罗氏血糖仪测血糖值。HOMA-IR=FINS*FPG/22.5。
1.5卵巢形态学检测大鼠10% 水合氯醛麻醉后处死。切取部分卵巢组织，常规石蜡包埋、切片以及HE 染色。
1.6统计学处理使用SPSS13.0软件，数据以均数±标准差（x±s）表示，其中HOMA-IR呈偏态分布，故取其自然对数（ln）后用均数±标准差（x±s）表示，进行两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
3讨论
目前，国内外针对PCOS已建立了多种造模方法，有雄激素造模法、雌激素造模法、孕激素联合HCG造模法、胰岛素联合HCG造模法、芳香化酶抑制剂造模法等，但这些造模方法都还不成熟完善，无法完全模拟临床上PCOS患者发病，研究认为临床上大部分PCOS患者尤其是具有IR和高胰岛素血症者，常伴有体质量的增加和脂肪代谢的紊乱[2-4]。
高脂饮食可能是女性多囊卵巢的发病诱因之一[5]，高脂饮食可诱导出IR，其机制可涉及胰岛素信号转导的多个环节，如胰岛素受体、胰岛素受体底物蛋白表达及磷酸化的减少，PI3K及PKB活性的改变等[6]，但一些研究认为单独应用高脂饲料构建的PCOS 模型在性激素及卵巢形态改变方面不典型，因此需与激素诱导法联合应用。丙酸睾丸酮是目前常用来PCOS造模的药物，桂文武等发现丙酸睾酮造模法，可使卵巢均呈多囊改变，睾酮、空腹血糖和空腹胰岛素水平升高[7]，为了使模型尽量符合人类PCOS的特点，本研究通过丙酸睾丸酮结合高脂饮食造模旨在更能使模型体现PCOS的高雄及高胰岛素的特征。
结果显示，丙酸睾丸酮结合高脂饮食造模组大鼠的卵巢出现了多囊卵巢的病理改变，表现为卵巢表面苍白，卵巢内黄体少见，卵泡多呈囊性扩张，除了卵巢形态学的改变，丙酸睾丸酮结合高脂饮食模型组大鼠具备PCOS典型的生理病理特征雄激素水平升高、LH/FSH比值升高，空腹胰岛素升高及其HOMA-IR显著高于对照组。说明此动物模型在卵巢形态学
和性激素分泌异常方面与PCOS患者类似，在糖代谢方面也与PCOS患者相似，因此，丙酸睾丸酮结合高脂饮食诱导的PCOS动物模型对于研究PCOS合并胰岛素抵抗的发生机制为一种理想的动物模型。参考文献： [1]Singh KB.Persistent estrus rat models o f polycystic ovary disease：an update[J].Fertility and Sterility，2005，84（S2）：1228-1234.
[2]Gambineri A，Pelusi C，Vicennati V，et al.Obesity and the polycystic ovary syndrome[J].Int J Obes Relat Metab Disord，2002，26（7）：883-896.
[3]Pasquali R，Gambineri A.Metabolic effects of obesity on reproduction[J].Reprod Biomed Online，2006，12（5）：542-551.
[4]Olszanecka-GlinianowiczM，BanasM，Zahorska-Markiewicz Z，et al.Insulin resistance and serum concentrations of ovarian and adrenal androgen in obese women without additional disease and with polycystic ovary syndrome[J].Endokrynol Pol，2005，56（6）：921-926.
[5]倪倩倩，朱梦娇，姚根宏，等.高脂肪饮食诱导多囊卵巢综合征表型改变的实验研究[J]，医学研究生学报，2014，27（2）：116-119.
[6]Youngren JF，Paik J，Barnard RJ.Impaired insulin-receptor autophosphorylation is an early defect in fat-fed，insulin resistant rats[J].J Appl Physiol，2001，91（5）：2240-2247.
[7]桂文武，陈静，丘彦，等.类多囊卵巢综合征大鼠模型的比较研究[J].中国比较医学杂志，2006，16（6）：330-332.
（收稿日期：2014-07-01）