【摘 要】
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为构建猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)诊断DNA微阵列,应用RT-PCR从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)C14-2分离株和欧洲型弱毒疫苗株VP046扩增并克隆获得美洲型重组质粒C14P9(基因号:
【基金项目】
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教育部长江学者和创新团队发展计划rn;
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为构建猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)诊断DNA微阵列,应用RT-PCR从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)C14-2分离株和欧洲型弱毒疫苗株VP046扩增并克隆获得美洲型重组质粒C14P9(基因号:AY7751 32)、PRRSPS9(基因号:AY775134)、U1b(基因号:AY7751 35)、Y11(基因号:AY775133)、Y12(基因号:AY775136)和欧洲型基因重组质粒E6和E8.PCR法制备的靶基因和探针纯化后,质量浓度分别为300～600 mg/L和200～400 mg/L.芯片杂交动力学研究表明,杂交信号强度随靶基因和探针浓度的增加而增强,最佳靶基因质量浓度为200 mg/L,探针适宜范围为3～3 000 μg/L,系统灵敏性为3 μg/L.靶基因杂交特异性研究表明,除个别靶基因在某一温度下存在交叉反应和杂交信号弱外,大多数靶基因在40～56 C下杂交信号强.采用AY775133、AY7751 34、E6和E8靶基因构建PRRS诊断DNA微阵列在40 C下预杂交1 h、48C湿盒避光杂交6 h后经洗涤和扫读分析,杂交信号强、斑点明显、特异性高,按SNR≥1.5为标准能够区分PRRSV美洲型和欧洲型.应用PRRS诊断DNA微阵列检测了AMERVAC-PRRS、PRRSV弱毒疫苗、C14-2株、SCU株和临床样本,能正确区分PRRSV基因型.研究结果表明构建的PRRS诊断DNA微阵列可用于PRRS临床诊断和基因分型.
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