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摘要：应用PCR扩增和测序技术获得了引进种岩扇贝（Crassadoma gigantea）及我国主要经济扇贝：虾夷扇贝（Patinopecten yessoensz‘s）、栉孔扇贝（Chlamys farreri）和海湾扇贝（Argopecten irradians）的12S rDNA全序列，并进行了相关分析。结果表明，四种扇贝12S rDNA的序列长度在906～964bp之间，其A+T含量在50.57%～56.77%之间；单倍型数、多态性位点数、单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数和平均核苷酸差异数分别在2～3、2～3、0.264～0.623、0.00075～0.00207和0.427～1.882之间，均表现出较低的遗传多样性水平；种间遗传距离在0.079～0.306之间，其中虾夷扇贝与栉孔扇贝的遗传距离最近，其次是岩扇贝与虾夷扇贝，而岩扇贝与海湾扇贝的遗传距离最远，并且系统进化树分析结果显示虾夷扇贝先与栉孔扇贝聚为一支，再与岩扇贝进行聚类，而海湾扇贝则与其它扇贝聚为另一个单系群，进一步阐明了四种扇贝间的亲缘关系。
关键词：12S rDNA；岩扇贝（Crassadoma gigantea）；遗传变异；亲缘关系 中图分类号：Q959 文献标志码：A
岩扇贝（Crassadoma gigantea）隶属于软体动物门（Mollusca）、瓣鳃纲（Lamellibranchia）、珍珠贝目（Pterioida）、扇贝科（Pectinidae），原产于北美洲太平洋沿岸海域。因其具有生长速度快、肉质鲜美以及抗逆性强等特点，在国外市场备受欢迎。目前国内主要养殖的扇贝种类有栉孔扇贝（Chlamys.farreri）、华贵栉孔扇贝（Mimachlamys nobilis）、海湾扇贝（Argopectenirradians）和虾夷扇贝（Patinopecten yessoen-sis）。然而，随着扇贝养殖产业的迅猛发展，纵观整个产业链存在诸多问题，如种质衰退严重、疾病灾害频发、品质下降等，而新物种的引进将成为解决问题的有效途径之一。因此，大连海洋大学曹善茂教授于2012年从加拿大引进岩扇贝种贝并繁育成功。目前，有关岩扇贝的研究主要集中在生理生态等方面，其遗传学研究在国内外却鲜见报道。作为外来引进新物种，对其遗传学及种质资源的评估资料仍处短缺状态，这将给生产应用带来很大困扰。
线粒体DNA具有母性遗传、结构简单、大小适中、缺乏重组、进化速率相对较快等特点，已广泛应用于种群遗传学、系统发生学和分子进化等相关研究，其中rRNA基因同时具有易变区和保守区，目前已作为可靠的分子标记广泛应用于动物的分子进化和系统发生等相关研究。因此，拟通过测定岩扇贝、栉孔扇贝、海湾扇贝、虾夷扇贝的mtDNA 12S rDNA序列，分析其遗传变异趋势，并结合GenBank其他扇贝的相应的基因序列进行系统进化分析，从分子水平上了解岩扇贝的遗传背景及其系统进化地位，以期为岩扇贝今后的遗传育种研究工作提供部分基础信息。
1材料与方法
1.1实验材料
本研究所使用的岩扇贝为由加拿大温哥华引进的种贝的F1代个体，为1龄贝养殖于大连龙王塘海域（代表符号：Y）；虾夷扇贝（代表符号：X）、栉孔扇贝（代表符号：Z）均购自于大连新长兴海产品市场，为2～3龄贝；海湾扇贝（代表符号：H）取自于山东莱州某养殖场，为1～2龄贝。采样时间均为2017年5月，每个种随机取10个样本，经形态学鉴定后取闭壳肌保存于无水乙醇中备用。
1.2实验方法
1.2.1基因组DNA提取 参考Sambrook等的酚/氯仿抽提法并略做修改。取2μL基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测基因组DNA的完整性，并取1μL在NanoDrop 2000微量分光光度计上测定浓度，最后稀释成约50ng/μL的工作液保存于4℃备用。
1.2.2引物 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。栉孔扇贝、虾夷扇贝及海湾扇贝的12S rDNA序列扩增根据GenBank中该物种线粒体基因組全序列设计特异性引物，使用Primer5软件进行引物设计，引物序列具体为：栉孔扇贝F：5’-TTTCTGCTCCGTGGTGTA-3’，R：5’-ATAGCCCTGCCCATAAGTT-3’；虾夷扇贝F：5’-：GTCGGACTTGGTC GTA-CAT-3’R：5-ATAGCCCTGCCCA TAAGTT-3’；海湾扇贝F：5’-AGCCTTCAGCCTA-AATGT-3’R：5-TCACCAC CAACCGAAT-AG-3’；而岩扇贝的12S rDNA序列则通过其它三种扇贝跨种扩增获得。
1.2.3测序 PCR反应总体系为25μL，包括1μL模板DNA（50ng/μL），2.5μL 10×reactionbuffer，1.0μL dNTP MIX（2.5 mM），1.0μL上下游混合引物（各10μM），0.2μL 1 U Taq DNA聚合酶，18.8μL超纯水；PCR反应条件是：94℃预变性5min；94℃变性35s，50℃退火40s，72℃延伸40s，进行38个循环；最后72℃充分延伸10min。PCR产物经BioSpin GelExtraction Kit纯化回收后，连接到pMDl8-T载体上，再转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑选阳性克隆送天一辉远（武汉）生物科技有限公司进行双向测序。
1.2.4数据分析 测序结果使用BioEdit7.0进行序列拼接；使用NCBI的BLAST工具搜索其它贝类的同源序列，下载扇贝科7种扇贝以及外源群两种贻贝的Cytb基因的同源序列（信息见表1）；ClustalX1.83对不同物种的DNA序列进行多重比对，使用GeneMarkS4.6b软件对岩扇贝的测序结果进行12S rRNA基因的预测；使用DNAsp5分析核酸基本参数，MEGA5.1计算碱基组成和遗传距离，并基于Neighbor-joining（NJ）法构建系统发育树。 2结果
2.112S r DNA序列得碱基组成
利用PCR测序技术获得了四种扇贝的12SrDNA全序列，碱基组成结果如表2所示。首先，四种扇贝12S rDNA序列长度在909～964pb之间，最长的为虾夷扇贝，其次是栉孔扇贝，最短的为岩扇贝。四种扇贝的A、T、G、C含量分别在27.709/6～29.59%、23.55%～27.17%、26.40%～28.61%和16.83%～20.81%之间，其A+T含量在50.57%～56.77%之间，最高为岩扇贝，最低为栉孔扇贝，但均大于G+C含量。
2.212S r DNA序列的遗传多样性
基于12S r DNA序列获得的四种扇贝的遗传变异参数如表3。首先，岩扇贝、栉孔扇贝、虾夷扇贝和海湾扇贝分别获得3、2、3、2个单倍型，无共有单倍型，多态性位点数依次为2、2、2、3，所有核苷酸变异位点均为转换和颠换变异（多态性核苷酸位点及各单倍型分情况详见表4）。四种扇贝的单倍型多样性指数（Hd）在0.264～0.623之间，其中岩夷扇贝最高，其次是虾夷扇贝，而栉孔扇贝最低；核苷酸多样性指数（7c）在O.00075～0.00207之间，其中海湾扇贝的值最高，其次是岩扇贝，而栉孔扇贝最低；平均核苷酸差异（k）在0.427～1.882之间，其中最高值为海湾扇贝，其次是岩扇贝，而栉孔扇贝。所有遗传变异参数中，π值和k值之间呈正相关关系。
2.3种间遗传距离及系统发育树
利用获得的所有12S r DNA序列计算了四种扇贝种间遗传距离，结果如表5。四种扇贝的遗传距离在0.079～0.306之间，其中栉孔扇贝与虾夷扇贝之间的遗传距离最近，之后依次为岩扇贝与虾夷扇贝（0.094）、岩扇贝与栉孔扇贝（0.105）、栉孔扇贝与海湾扇贝（0.280）、虾夷扇贝与海湾扇贝（0.289），而岩扇贝与海湾扇贝之间的遗传距离最远。
2.4系统发育树构建
利用获得的四种扇贝的所有12S r DNA单倍型序列，并结合GenBank数据库中其他扇贝的相应序列，基于邻接法Neighbor-Joining（NJ）构建系统发育树，选取蚶科的两个种作为外源群，结果如图1。除外源群物种独自聚为一个分支以外，扇贝科的所有物种分为两个单系群，其中一个单系群包括虾夷扇贝的3个单倍型、栉孔扇贝的2个单倍型、岩扇贝的3个单倍型以及Mimachlamys、Pecten两个属的物种，每个属的物种又独自聚为一个小分支，具体为虾夷扇贝先与栉孔扇贝聚为一支，再与岩扇贝聚类，之后与Mimachlamys聚类，最后与Pecten聚为一个单系群；而Argopecten的四个种则独自聚为另一个单系群，其中海湾扇贝与其亚种墨西哥海湾扇贝聚为一个小分支，而另两个种聚为一个小分支。
3讨论
3.112S r DNA的序列特征及遗传多样性
DNA序列分析是鉴定生物亲缘种，研究系统进化关系的方法之一。12S rRNA属线粒体基因，在动物进化机制和系统发育研究上是一种有效的分子标记。本研究获得的四种扇贝的12Sr DNA全序列经Clustal比对发现，四种扇贝的12S r DNA序列同源性较低，种间变异较大。但四种扇贝的序列长度并无明显的种间长度多态，这在其它动物的研究中也存在类似的现象。另外，四种扇贝的12S r DNA序列的A+T含量均大于G+C含量，符合动物线粒体基因的碱基组成特征，并与其它贝类的研究结果相一致。
遗传多样性是物种延续和发展的基础，其丰富的种群在复杂多变的自然环境中表现出更强的适应性。而通常来说，核苷酸多样性指数（π）和单倍型多样性指数（Hd）是评估种群遗传多样性的两个重要指标，但由于单个碱基的变异就能生成一种新的单倍型，Hd值可在短时间内积累变异而快速提高，而丌值的提高需要长时间的积累，因此兀值在衡量种群遗传多样性时比Hd值更具代表性。本研究中，四种扇贝的π值在0.00045～0.00207之间。但Lan等认为，当π值低于0.0047时，则表明遗传多样性处于较低水平，说明本研究中采样区的四种扇贝均表现出较低的遗传多样性水平。其原因可能与实验样本均为养殖群体有关。
3.2遺传距离及系统发育分析
物种间的遗传距离是衡量其亲缘关系的重要指标。本研究中栉孔扇贝与虾夷扇贝之间的遗传距离最近，表明其亲缘关系最近，此部分结果与秦艳杰等应用AFLP技术的研究结果一致，而岩扇贝与海湾扇贝之间的亲缘关系较远。其次，岩扇贝与其它三种扇贝之间则表现为岩扇贝与虾夷扇贝的亲缘关系最近，而与海湾扇贝之间的亲缘关系较远。
目前，在扇贝系统进化方面已有大量的研究报道，如Insua等和Jose Lopez-Pinon等分别利用ITSI和5S rDNA序列对欧洲的四种扇贝进行了亲缘关系探讨；胡丽萍等和Canapa等利用16S rDNA部分序列进行了相关研究；而Barucca等和Puslednik等则同时利用16S rDNA和12S rDNA序列构建了扇贝的系统进化树。其中，Puslednik等的研究对象较为丰富，包括本研究中的虾夷扇贝、海湾扇贝以及引进种岩扇贝在内，但该研究获得的仅为相应基因的部分序列，而非基因全序列。尽管缺失了栉孔扇贝，但其结果显示虾夷扇贝与Chlamys的冰岛扇贝独自聚为一个分支，再与岩扇贝进行聚类，而海湾扇贝则与其它扇贝聚在另外一个大分支。本研究中虾夷扇贝与栉孔扇贝聚为一个分支，再与岩扇贝进行聚类，而海湾扇贝聚为另一个单系群。两者的研究表现出极大的相似性。
4结论
综上所述，本研究利用PCR扩增及测序技术，获得了岩扇贝、海湾扇贝、虾夷扇贝和栉孔扇贝的mtDNA 12S r DNA全序列，并进行了遗传变异水平及系统进化分析。结果表明：采样区四种扇贝均表现出较低的遗传多样性水平，并且四种扇贝之间，虾夷扇贝与栉孔扇贝的遗传距离最近，其次是岩扇贝与虾夷扇贝，而岩扇贝与海湾扇贝的遗传距离最远，阐明了四种扇贝之间的亲缘关系。该研究结果将为岩扇贝的引种与推广养殖以及今后的遗传育种研究工作提供参考信息。
（收稿日期：2017-12-27）
关键词：12S rDNA；岩扇贝（Crassadoma gigantea）；遗传变异；亲缘关系 中图分类号：Q959 文献标志码：A
岩扇贝（Crassadoma gigantea）隶属于软体动物门（Mollusca）、瓣鳃纲（Lamellibranchia）、珍珠贝目（Pterioida）、扇贝科（Pectinidae），原产于北美洲太平洋沿岸海域。因其具有生长速度快、肉质鲜美以及抗逆性强等特点，在国外市场备受欢迎。目前国内主要养殖的扇贝种类有栉孔扇贝（Chlamys.farreri）、华贵栉孔扇贝（Mimachlamys nobilis）、海湾扇贝（Argopectenirradians）和虾夷扇贝（Patinopecten yessoen-sis）。然而，随着扇贝养殖产业的迅猛发展，纵观整个产业链存在诸多问题，如种质衰退严重、疾病灾害频发、品质下降等，而新物种的引进将成为解决问题的有效途径之一。因此，大连海洋大学曹善茂教授于2012年从加拿大引进岩扇贝种贝并繁育成功。目前，有关岩扇贝的研究主要集中在生理生态等方面，其遗传学研究在国内外却鲜见报道。作为外来引进新物种，对其遗传学及种质资源的评估资料仍处短缺状态，这将给生产应用带来很大困扰。
线粒体DNA具有母性遗传、结构简单、大小适中、缺乏重组、进化速率相对较快等特点，已广泛应用于种群遗传学、系统发生学和分子进化等相关研究，其中rRNA基因同时具有易变区和保守区，目前已作为可靠的分子标记广泛应用于动物的分子进化和系统发生等相关研究。因此，拟通过测定岩扇贝、栉孔扇贝、海湾扇贝、虾夷扇贝的mtDNA 12S rDNA序列，分析其遗传变异趋势，并结合GenBank其他扇贝的相应的基因序列进行系统进化分析，从分子水平上了解岩扇贝的遗传背景及其系统进化地位，以期为岩扇贝今后的遗传育种研究工作提供部分基础信息。
1材料与方法
1.1实验材料
本研究所使用的岩扇贝为由加拿大温哥华引进的种贝的F1代个体，为1龄贝养殖于大连龙王塘海域（代表符号：Y）；虾夷扇贝（代表符号：X）、栉孔扇贝（代表符号：Z）均购自于大连新长兴海产品市场，为2～3龄贝；海湾扇贝（代表符号：H）取自于山东莱州某养殖场，为1～2龄贝。采样时间均为2017年5月，每个种随机取10个样本，经形态学鉴定后取闭壳肌保存于无水乙醇中备用。
1.2实验方法
1.2.1基因组DNA提取 参考Sambrook等的酚/氯仿抽提法并略做修改。取2μL基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测基因组DNA的完整性，并取1μL在NanoDrop 2000微量分光光度计上测定浓度，最后稀释成约50ng/μL的工作液保存于4℃备用。
1.2.2引物 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。栉孔扇贝、虾夷扇贝及海湾扇贝的12S rDNA序列扩增根据GenBank中该物种线粒体基因組全序列设计特异性引物，使用Primer5软件进行引物设计，引物序列具体为：栉孔扇贝F：5’-TTTCTGCTCCGTGGTGTA-3’，R：5’-ATAGCCCTGCCCATAAGTT-3’；虾夷扇贝F：5’-：GTCGGACTTGGTC GTA-CAT-3’R：5-ATAGCCCTGCCCA TAAGTT-3’；海湾扇贝F：5’-AGCCTTCAGCCTA-AATGT-3’R：5-TCACCAC CAACCGAAT-AG-3’；而岩扇贝的12S rDNA序列则通过其它三种扇贝跨种扩增获得。
1.2.3测序 PCR反应总体系为25μL，包括1μL模板DNA（50ng/μL），2.5μL 10×reactionbuffer，1.0μL dNTP MIX（2.5 mM），1.0μL上下游混合引物（各10μM），0.2μL 1 U Taq DNA聚合酶，18.8μL超纯水；PCR反应条件是：94℃预变性5min；94℃变性35s，50℃退火40s，72℃延伸40s，进行38个循环；最后72℃充分延伸10min。PCR产物经BioSpin GelExtraction Kit纯化回收后，连接到pMDl8-T载体上，再转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑选阳性克隆送天一辉远（武汉）生物科技有限公司进行双向测序。
1.2.4数据分析 测序结果使用BioEdit7.0进行序列拼接；使用NCBI的BLAST工具搜索其它贝类的同源序列，下载扇贝科7种扇贝以及外源群两种贻贝的Cytb基因的同源序列（信息见表1）；ClustalX1.83对不同物种的DNA序列进行多重比对，使用GeneMarkS4.6b软件对岩扇贝的测序结果进行12S rRNA基因的预测；使用DNAsp5分析核酸基本参数，MEGA5.1计算碱基组成和遗传距离，并基于Neighbor-joining（NJ）法构建系统发育树。 2结果
2.112S r DNA序列得碱基组成
利用PCR测序技术获得了四种扇贝的12SrDNA全序列，碱基组成结果如表2所示。首先，四种扇贝12S rDNA序列长度在909～964pb之间，最长的为虾夷扇贝，其次是栉孔扇贝，最短的为岩扇贝。四种扇贝的A、T、G、C含量分别在27.709/6～29.59%、23.55%～27.17%、26.40%～28.61%和16.83%～20.81%之间，其A+T含量在50.57%～56.77%之间，最高为岩扇贝，最低为栉孔扇贝，但均大于G+C含量。
2.212S r DNA序列的遗传多样性
基于12S r DNA序列获得的四种扇贝的遗传变异参数如表3。首先，岩扇贝、栉孔扇贝、虾夷扇贝和海湾扇贝分别获得3、2、3、2个单倍型，无共有单倍型，多态性位点数依次为2、2、2、3，所有核苷酸变异位点均为转换和颠换变异（多态性核苷酸位点及各单倍型分情况详见表4）。四种扇贝的单倍型多样性指数（Hd）在0.264～0.623之间，其中岩夷扇贝最高，其次是虾夷扇贝，而栉孔扇贝最低；核苷酸多样性指数（7c）在O.00075～0.00207之间，其中海湾扇贝的值最高，其次是岩扇贝，而栉孔扇贝最低；平均核苷酸差异（k）在0.427～1.882之间，其中最高值为海湾扇贝，其次是岩扇贝，而栉孔扇贝。所有遗传变异参数中，π值和k值之间呈正相关关系。
2.3种间遗传距离及系统发育树
利用获得的所有12S r DNA序列计算了四种扇贝种间遗传距离，结果如表5。四种扇贝的遗传距离在0.079～0.306之间，其中栉孔扇贝与虾夷扇贝之间的遗传距离最近，之后依次为岩扇贝与虾夷扇贝（0.094）、岩扇贝与栉孔扇贝（0.105）、栉孔扇贝与海湾扇贝（0.280）、虾夷扇贝与海湾扇贝（0.289），而岩扇贝与海湾扇贝之间的遗传距离最远。
2.4系统发育树构建
利用获得的四种扇贝的所有12S r DNA单倍型序列，并结合GenBank数据库中其他扇贝的相应序列，基于邻接法Neighbor-Joining（NJ）构建系统发育树，选取蚶科的两个种作为外源群，结果如图1。除外源群物种独自聚为一个分支以外，扇贝科的所有物种分为两个单系群，其中一个单系群包括虾夷扇贝的3个单倍型、栉孔扇贝的2个单倍型、岩扇贝的3个单倍型以及Mimachlamys、Pecten两个属的物种，每个属的物种又独自聚为一个小分支，具体为虾夷扇贝先与栉孔扇贝聚为一支，再与岩扇贝聚类，之后与Mimachlamys聚类，最后与Pecten聚为一个单系群；而Argopecten的四个种则独自聚为另一个单系群，其中海湾扇贝与其亚种墨西哥海湾扇贝聚为一个小分支，而另两个种聚为一个小分支。
3讨论
3.112S r DNA的序列特征及遗传多样性
DNA序列分析是鉴定生物亲缘种，研究系统进化关系的方法之一。12S rRNA属线粒体基因，在动物进化机制和系统发育研究上是一种有效的分子标记。本研究获得的四种扇贝的12Sr DNA全序列经Clustal比对发现，四种扇贝的12S r DNA序列同源性较低，种间变异较大。但四种扇贝的序列长度并无明显的种间长度多态，这在其它动物的研究中也存在类似的现象。另外，四种扇贝的12S r DNA序列的A+T含量均大于G+C含量，符合动物线粒体基因的碱基组成特征，并与其它贝类的研究结果相一致。
遗传多样性是物种延续和发展的基础，其丰富的种群在复杂多变的自然环境中表现出更强的适应性。而通常来说，核苷酸多样性指数（π）和单倍型多样性指数（Hd）是评估种群遗传多样性的两个重要指标，但由于单个碱基的变异就能生成一种新的单倍型，Hd值可在短时间内积累变异而快速提高，而丌值的提高需要长时间的积累，因此兀值在衡量种群遗传多样性时比Hd值更具代表性。本研究中，四种扇贝的π值在0.00045～0.00207之间。但Lan等认为，当π值低于0.0047时，则表明遗传多样性处于较低水平，说明本研究中采样区的四种扇贝均表现出较低的遗传多样性水平。其原因可能与实验样本均为养殖群体有关。
3.2遺传距离及系统发育分析
物种间的遗传距离是衡量其亲缘关系的重要指标。本研究中栉孔扇贝与虾夷扇贝之间的遗传距离最近，表明其亲缘关系最近，此部分结果与秦艳杰等应用AFLP技术的研究结果一致，而岩扇贝与海湾扇贝之间的亲缘关系较远。其次，岩扇贝与其它三种扇贝之间则表现为岩扇贝与虾夷扇贝的亲缘关系最近，而与海湾扇贝之间的亲缘关系较远。
目前，在扇贝系统进化方面已有大量的研究报道，如Insua等和Jose Lopez-Pinon等分别利用ITSI和5S rDNA序列对欧洲的四种扇贝进行了亲缘关系探讨；胡丽萍等和Canapa等利用16S rDNA部分序列进行了相关研究；而Barucca等和Puslednik等则同时利用16S rDNA和12S rDNA序列构建了扇贝的系统进化树。其中，Puslednik等的研究对象较为丰富，包括本研究中的虾夷扇贝、海湾扇贝以及引进种岩扇贝在内，但该研究获得的仅为相应基因的部分序列，而非基因全序列。尽管缺失了栉孔扇贝，但其结果显示虾夷扇贝与Chlamys的冰岛扇贝独自聚为一个分支，再与岩扇贝进行聚类，而海湾扇贝则与其它扇贝聚在另外一个大分支。本研究中虾夷扇贝与栉孔扇贝聚为一个分支，再与岩扇贝进行聚类，而海湾扇贝聚为另一个单系群。两者的研究表现出极大的相似性。
4结论
综上所述，本研究利用PCR扩增及测序技术，获得了岩扇贝、海湾扇贝、虾夷扇贝和栉孔扇贝的mtDNA 12S r DNA全序列，并进行了遗传变异水平及系统进化分析。结果表明：采样区四种扇贝均表现出较低的遗传多样性水平，并且四种扇贝之间，虾夷扇贝与栉孔扇贝的遗传距离最近，其次是岩扇贝与虾夷扇贝，而岩扇贝与海湾扇贝的遗传距离最远，阐明了四种扇贝之间的亲缘关系。该研究结果将为岩扇贝的引种与推广养殖以及今后的遗传育种研究工作提供参考信息。
（收稿日期：2017-12-27）