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摘 要：本文建立了超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪测定辣椒油中溶剂红52含量的方法。结果表明，辣椒油中的溶剂红52在0.01～0.50mg/kg范围内线性关系良好，其方法检出限为0.003mg/kg，定量限为0.01mg/kg，添加回收率在89%～95%之间，相对标准偏差（n=6）在1.4%～6.5%之间。由此可见，该方法精密度好，回收率高，能够满足企业和相关部门的管控要求。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱 溶剂红52 辣椒油 检测
溶剂红是一类含有特殊鲜艳红色的人工合成染料，由于其价格低廉、颜色亮丽，故被广泛用于各类纺织品、色素、塑料着色剂等工业领域[1]。常见的溶剂红染料类型有溶剂红49（罗丹明B）、溶剂红111、溶剂红52、溶剂红23（苏丹红III）等等[2]。溶剂红染料在合成过程中容易生成一些副产物，如芳香胺等强致癌物质，且其本身也具有明显的毒副作用。某些不法生产者为了使产品更加鲜艳出众，在食品生产过程中违法添加具有致癌性的溶剂红染料，给消费者的身体健康带来了极大的安全隐患[3，4]。
2005年，多款辣椒酱、红鸭蛋等食品中被检测出含有禁用成分“苏丹红一号”[5]，该事件逐渐发酵并酿成了一起重大食品安全卫生事件。此后，相关部门对于食品中违禁染料“苏丹红”的检测力度[6-8]提升到了一个新高度，也在一定程度上杜绝了“苏丹红”染料的违法添加问题。然而，随着时间的流逝，一些不法生产者受利益驱动铤而走险，改用其它染料替代“苏丹红”，如溶剂红49、溶剂红52等，以躲避相关监管部门的检验。
溶剂红52是一种功能性溶剂染料，能够对各种塑料树脂及纤维着色，其化学名称为3-甲基-6-（对甲苯胺基）-3H-二苯并[f，ij]异喹啉-2，7-二酮，结构如图1。虽然溶剂红52具有艳丽的红色及优良的着色性能[9]，但它只是一种化工染料，并不包含在食品及食品接触材料使用添加剂的正面清单内[10，11]。目前，对于溶剂红52的定量检测方法鲜见报道。因此，建立食品中溶剂红52含量的检测方法不仅能够为执法部门的检验监管提供支撑，更有助于维护消费者的健康安全。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器
液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（6460），Agilent;移液枪，Eppendorf;超声仪，上海科导;涡漩振荡器，上海达姆;离心机，Sigma;纯水仪，Millipore。
1.1.2 试剂耗材
一级水，由超纯水设備生成;溶剂红52（CAS：81-39-0），购自朗盛化学;辣椒油为市售品;乙酸乙酯、正己烷均为色谱纯，乙腈、甲醇为LC/MS级，微孔滤膜（0.22μm），均购自上海安谱;具塞玻璃离心管（25mL），购自泰坦科技。
1.2 标准溶液的配制
分别准确称取0.025g（精确到0.1mg）溶剂红52至25mL容量瓶中，加入1mL水溶解后，再用甲醇定容，在4°C条件下避光保存，此为溶剂红52的标准储备液。系列标准溶液由混合标准储备液用甲醇/水（v/v=50/50）稀释而得。
1.3 样品前处理
由分析天平准确称取1g（精确至0.1mg）辣椒油液体试样于25mL玻璃离心管中，加入5mL甲醇，涡漩振荡2分钟。随后，将离心管置于离心机中以4000r/min离心10分钟，将上层甲醇溶液全部移出。之后，加入5mL甲醇于离心管中，重复提取一次，合并两次甲醇提取液，氮吹至近干，加入1.0mL甲醇/水溶液（v/v=50/50）涡漩15秒溶解，溶液过0.22μm滤膜后供高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪进行检测。
1.4 分析方法
1.4.1 液相色谱条件
色谱柱为ZOBRAX-C18，3.5?m（3.5μm，2.1×150mm）;流动相A：水，流动相B：甲醇，A︰B=20︰80，等度洗脱;进样量：1.0μL;流速：0.30mL/min;柱温：35℃。
1.4.2 质谱参考条件
离子化模式：电喷雾电离（ESI），正离子模式;质谱扫描方式：多反应监测（MRM）;干燥气流速：10L/min;喷雾电压：4500V;离子源温度：350℃;干燥器温度：350℃;雾化器压力：45psi;裂解电压：135V;MRM参数见表1。
2 结果与讨论
2.1 提取溶剂的选择
通过对含有溶剂红52的辣椒油样品进行溶剂提取，考察了乙腈、甲醇、水、正己烷和乙酸乙酯这5种不同的溶剂。结果表明，正己烷、乙酸乙酯与辣椒油无法分层;乙腈、甲醇的提取效率比较接近，而水的提取效率低于上述两种溶剂。考虑到乙腈的毒性较大，且甲醇性价比较高，因此最终选择甲醇作为提取溶剂。
2.2 提取方式和提取次数的选择
确定了以甲醇为提取溶剂后，通过比较超声、涡漩振荡两种提取模式对阳性样品进行提取。结果表明，涡漩振荡提取效率更高，且时间更短，故最终采用涡漩振荡作为提取方式。然后，继续考察提取次数的影响。结果显示，对同一个加标阳性样品提取两次后的回收率大于99%，因此最终确定提取次数为两次。
2.3 色谱柱和流动相的选择
对于色谱柱的选择，发现采用C18即可满足要求，因此采用ZOBRAX-C18（3.5μm，2.1×150mm）窄径柱，其能有效提高分离效率并节省分析时间。通过优化流动相发现，乙腈-水体系和甲醇-水体系均能较好地得到目标物的色谱峰。综合考虑试剂的毒性、价格成本及提取效果等因素，最终选用甲醇-水为流动相，采用等度洗脱（甲醇︰水=80︰20）进行色谱分离，整个分析时间不超过5分钟，其色谱图如图2。
2.4 方法检出限和限性范围 通过配置浓度范围为0.01、0.02、0.04、0.10、0.20、0.50mg/L的系列标准溶液，在选定的色谱条件下进行测定，以各目标化合物的浓度为横坐标，响应面积为纵坐标，进行外标法定量。结果表明，其在0.01～0.50mg/kg范围内线性良好（R2=0.998）。通过逐级稀释标准溶液后进行液相色谱-串联质谱检测，以3倍信噪比估算所对应目标物的检出限，10倍信噪比估算定量限。结果表明，辣椒油中溶剂红52的检出限为0.003mg/kg，定量限为0.01mg/kg。
2.5 精密度实验
为了验证方法的有效性，本文通过对阴性样品进行加标回收实验，即向不含溶剂红52的辣椒油样品中添加0.01、0.05、0.50mg/kg这3个水平的溶剂红目标物，每个含量平行测定8次。结果表明，不同水平的添加回收率在89%～97%之间，其RSD的范围为1.4%～6.5%，具体结果如表2。
2.6 实际样品检测
在市面上采購了6批不同厂商生产的辣椒油样品进行溶剂红52的检测，均未检出该物质，表明市面上辣椒油中溶剂红52的违法添加风险较小。
3 结论
本研究采用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，建立了辣椒油中溶剂红52的定量检测方法，检出限为0.003mg/kg，定量限为0.01mg/kg。可见该方法准确可靠，灵敏度高，能够对相关辣椒油产品进行检验监管，有助于打击违法分子，帮助企业和相关政府部门保障消费者的食品卫生安全。
参考文献：
[1] 黄永辉，奚旦立，陈季华，等.不同类型染料的缺氧生物降解性能研究[J].印染，2002，28（10）：1-3.
[2] 董春艳，王红强，马飞飞，等.以双乙烯酮为酰化剂制备出的一些溶剂染料的概况[J].乙醛醋酸化工，2017，（05）：8-13.
[3] 王宏伟，刘素丽，赵梅，等.食品中非法添加工业染料危害的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2019，10（01）：1-7.
[4] 路勇，渠岩，冯楠，等.超高效液相色谱-串联四极杆质谱法快速筛查食品中的45种工业染料[J].食品科学，2012，33（6）：176-180.
[5] 吴楚平.苏丹红一号事件[J].食品科技，2005，（09）：28-30.
[6] 米建萍，刘青华，黄峥，等.食品中苏丹红检测方法的应用进展[J].分析试验室，2008，27，427-431.
[7] 郝家勇，陈霞，李红敏.超高效液相色谱-串联四级杆质谱法测定辣椒制品中的4种苏丹红[J].现代食品科技，2014，30（11），235-240.
[8] 徐于栋.食品基质中苏丹红检测方法的研究进展[J].粮食与食品工业，2019，26（5）：65-68.
[9] 季浩，蒲爱军，刘晓梅，等.C.I.溶剂红52中对甲苯胺含量的测定[J].2016，53（2）：50-53.
[10] 《食品接触材料及制品用添加剂使用标准》（GB 9685-2016）[S].食品安全国家标准，2016.
[11] EU 10/2011. Union Guidelines on Regulation （EU） No 10/2011 on plastic materials and articles intended to come into contact with food[S]. 2011.
关键词：超高效液相色谱-串联质谱 溶剂红52 辣椒油 检测
溶剂红是一类含有特殊鲜艳红色的人工合成染料，由于其价格低廉、颜色亮丽，故被广泛用于各类纺织品、色素、塑料着色剂等工业领域[1]。常见的溶剂红染料类型有溶剂红49（罗丹明B）、溶剂红111、溶剂红52、溶剂红23（苏丹红III）等等[2]。溶剂红染料在合成过程中容易生成一些副产物，如芳香胺等强致癌物质，且其本身也具有明显的毒副作用。某些不法生产者为了使产品更加鲜艳出众，在食品生产过程中违法添加具有致癌性的溶剂红染料，给消费者的身体健康带来了极大的安全隐患[3，4]。
2005年，多款辣椒酱、红鸭蛋等食品中被检测出含有禁用成分“苏丹红一号”[5]，该事件逐渐发酵并酿成了一起重大食品安全卫生事件。此后，相关部门对于食品中违禁染料“苏丹红”的检测力度[6-8]提升到了一个新高度，也在一定程度上杜绝了“苏丹红”染料的违法添加问题。然而，随着时间的流逝，一些不法生产者受利益驱动铤而走险，改用其它染料替代“苏丹红”，如溶剂红49、溶剂红52等，以躲避相关监管部门的检验。
溶剂红52是一种功能性溶剂染料，能够对各种塑料树脂及纤维着色，其化学名称为3-甲基-6-（对甲苯胺基）-3H-二苯并[f，ij]异喹啉-2，7-二酮，结构如图1。虽然溶剂红52具有艳丽的红色及优良的着色性能[9]，但它只是一种化工染料，并不包含在食品及食品接触材料使用添加剂的正面清单内[10，11]。目前，对于溶剂红52的定量检测方法鲜见报道。因此，建立食品中溶剂红52含量的检测方法不仅能够为执法部门的检验监管提供支撑，更有助于维护消费者的健康安全。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器
液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（6460），Agilent;移液枪，Eppendorf;超声仪，上海科导;涡漩振荡器，上海达姆;离心机，Sigma;纯水仪，Millipore。
1.1.2 试剂耗材
一级水，由超纯水设備生成;溶剂红52（CAS：81-39-0），购自朗盛化学;辣椒油为市售品;乙酸乙酯、正己烷均为色谱纯，乙腈、甲醇为LC/MS级，微孔滤膜（0.22μm），均购自上海安谱;具塞玻璃离心管（25mL），购自泰坦科技。
1.2 标准溶液的配制
分别准确称取0.025g（精确到0.1mg）溶剂红52至25mL容量瓶中，加入1mL水溶解后，再用甲醇定容，在4°C条件下避光保存，此为溶剂红52的标准储备液。系列标准溶液由混合标准储备液用甲醇/水（v/v=50/50）稀释而得。
1.3 样品前处理
由分析天平准确称取1g（精确至0.1mg）辣椒油液体试样于25mL玻璃离心管中，加入5mL甲醇，涡漩振荡2分钟。随后，将离心管置于离心机中以4000r/min离心10分钟，将上层甲醇溶液全部移出。之后，加入5mL甲醇于离心管中，重复提取一次，合并两次甲醇提取液，氮吹至近干，加入1.0mL甲醇/水溶液（v/v=50/50）涡漩15秒溶解，溶液过0.22μm滤膜后供高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪进行检测。
1.4 分析方法
1.4.1 液相色谱条件
色谱柱为ZOBRAX-C18，3.5?m（3.5μm，2.1×150mm）;流动相A：水，流动相B：甲醇，A︰B=20︰80，等度洗脱;进样量：1.0μL;流速：0.30mL/min;柱温：35℃。
1.4.2 质谱参考条件
离子化模式：电喷雾电离（ESI），正离子模式;质谱扫描方式：多反应监测（MRM）;干燥气流速：10L/min;喷雾电压：4500V;离子源温度：350℃;干燥器温度：350℃;雾化器压力：45psi;裂解电压：135V;MRM参数见表1。
2 结果与讨论
2.1 提取溶剂的选择
通过对含有溶剂红52的辣椒油样品进行溶剂提取，考察了乙腈、甲醇、水、正己烷和乙酸乙酯这5种不同的溶剂。结果表明，正己烷、乙酸乙酯与辣椒油无法分层;乙腈、甲醇的提取效率比较接近，而水的提取效率低于上述两种溶剂。考虑到乙腈的毒性较大，且甲醇性价比较高，因此最终选择甲醇作为提取溶剂。
2.2 提取方式和提取次数的选择
确定了以甲醇为提取溶剂后，通过比较超声、涡漩振荡两种提取模式对阳性样品进行提取。结果表明，涡漩振荡提取效率更高，且时间更短，故最终采用涡漩振荡作为提取方式。然后，继续考察提取次数的影响。结果显示，对同一个加标阳性样品提取两次后的回收率大于99%，因此最终确定提取次数为两次。
2.3 色谱柱和流动相的选择
对于色谱柱的选择，发现采用C18即可满足要求，因此采用ZOBRAX-C18（3.5μm，2.1×150mm）窄径柱，其能有效提高分离效率并节省分析时间。通过优化流动相发现，乙腈-水体系和甲醇-水体系均能较好地得到目标物的色谱峰。综合考虑试剂的毒性、价格成本及提取效果等因素，最终选用甲醇-水为流动相，采用等度洗脱（甲醇︰水=80︰20）进行色谱分离，整个分析时间不超过5分钟，其色谱图如图2。
2.4 方法检出限和限性范围 通过配置浓度范围为0.01、0.02、0.04、0.10、0.20、0.50mg/L的系列标准溶液，在选定的色谱条件下进行测定，以各目标化合物的浓度为横坐标，响应面积为纵坐标，进行外标法定量。结果表明，其在0.01～0.50mg/kg范围内线性良好（R2=0.998）。通过逐级稀释标准溶液后进行液相色谱-串联质谱检测，以3倍信噪比估算所对应目标物的检出限，10倍信噪比估算定量限。结果表明，辣椒油中溶剂红52的检出限为0.003mg/kg，定量限为0.01mg/kg。
2.5 精密度实验
为了验证方法的有效性，本文通过对阴性样品进行加标回收实验，即向不含溶剂红52的辣椒油样品中添加0.01、0.05、0.50mg/kg这3个水平的溶剂红目标物，每个含量平行测定8次。结果表明，不同水平的添加回收率在89%～97%之间，其RSD的范围为1.4%～6.5%，具体结果如表2。
2.6 实际样品检测
在市面上采購了6批不同厂商生产的辣椒油样品进行溶剂红52的检测，均未检出该物质，表明市面上辣椒油中溶剂红52的违法添加风险较小。
3 结论
本研究采用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，建立了辣椒油中溶剂红52的定量检测方法，检出限为0.003mg/kg，定量限为0.01mg/kg。可见该方法准确可靠，灵敏度高，能够对相关辣椒油产品进行检验监管，有助于打击违法分子，帮助企业和相关政府部门保障消费者的食品卫生安全。
参考文献：
[1] 黄永辉，奚旦立，陈季华，等.不同类型染料的缺氧生物降解性能研究[J].印染，2002，28（10）：1-3.
[2] 董春艳，王红强，马飞飞，等.以双乙烯酮为酰化剂制备出的一些溶剂染料的概况[J].乙醛醋酸化工，2017，（05）：8-13.
[3] 王宏伟，刘素丽，赵梅，等.食品中非法添加工业染料危害的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2019，10（01）：1-7.
[4] 路勇，渠岩，冯楠，等.超高效液相色谱-串联四极杆质谱法快速筛查食品中的45种工业染料[J].食品科学，2012，33（6）：176-180.
[5] 吴楚平.苏丹红一号事件[J].食品科技，2005，（09）：28-30.
[6] 米建萍，刘青华，黄峥，等.食品中苏丹红检测方法的应用进展[J].分析试验室，2008，27，427-431.
[7] 郝家勇，陈霞，李红敏.超高效液相色谱-串联四级杆质谱法测定辣椒制品中的4种苏丹红[J].现代食品科技，2014，30（11），235-240.
[8] 徐于栋.食品基质中苏丹红检测方法的研究进展[J].粮食与食品工业，2019，26（5）：65-68.
[9] 季浩，蒲爱军，刘晓梅，等.C.I.溶剂红52中对甲苯胺含量的测定[J].2016，53（2）：50-53.
[10] 《食品接触材料及制品用添加剂使用标准》（GB 9685-2016）[S].食品安全国家标准，2016.
[11] EU 10/2011. Union Guidelines on Regulation （EU） No 10/2011 on plastic materials and articles intended to come into contact with food[S]. 2011.