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摘 要:目的:运用HPLC法测定法对不同产地药材陈皮中橙皮苷含量进行测量。方法:应用Discovery C18色谱柱,使用的流动相为甲醇、冰醋酸、水,彼此之间的比例为35:5:60,通过检测最适宜的波长为283nm,最适宜的流速应该是1.0ml/min。结果:橙皮苷处于21.43-2143μg/ml之间时,拥有比较好的线性关系,平均回收率也非常高,达到了98.78%,结果表明,药材陈皮产地不同,橙皮苷含量也有一定的区别。结论:运用PLC法来对不同产地药材陈皮中橙皮苷含量测量具有非常突出的优势,简单快捷,具有非常好的准确性,而且重复性也非常好,值得推广应用。
关键词:HPLC法;陈皮;橙皮苷;运用
我国多地都有种植陈皮,比如福建、广东等地。陈皮是一味中草药,主要功能有理气健脾、燥湿化痰等,主要用来治疗食少吐泻、胸闷等疾病。陈皮中最重要的成分就是橙皮苷。很多研究者应用紫外分光光度法对陈皮中的橙皮苷进行检测,效果不佳,尤其表现在专属性差。有报道称,运用HPLC法测定陈皮中橙皮苷含量测量具有非常好的效果。为此本文采用HPLC法,对来自于6种不同产地的陈皮中的橙皮苷进行测定。
1 仪器与试药
1.1 仪器
美国,Discovery,C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),美国Water717,高效液相色谱仪器,紫外检测器为,SPD-10Avp,美国梅特勒-托利多,AL204,分析天平(精确度,0.0001g),郑州宏朗DZKW-D-6,型电热恒温水浴锅,济宁万和,Model,C9860A,超声波清洗脱气机器,河北,DZF-6021,型真空干燥箱。
1.2 试剂:甲醇溶液为色谱纯,冰醋酸为分析纯,水为三蒸水。
1.3 试药:橙皮苷对照组(购于中国药品生物制品检定所,批号:130825-200921),6,批不同产地陈皮药材均购于各地方的药材公司,经我当地药品检验所鉴定均为正品。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
应用Discovery C18色谱柱,将甲醇:冰醋酸:水=35:5:60,作为流动相,检测波长确定为283nm,流速确定为1.0mL/min,色谱柱温度确定为25上℃,进样量确定为20ΜL。
2.2 溶液制备
2.2.1 制备对照品溶液。运用天平称取5mg橙皮苷,该对照品必须要经过P2O5,再通过室温减压,而后再进行干燥24h才可使用,将对照品放入到25μL容量瓶中,而后添加甲醇溶液,待到指定刻度后,摇晃均匀,静置一段时间后,即得到对照品溶液。选择应用精密仪器称取对照品溶液,共5μL,而后将流动相溶液放入到25μL容量瓶中,摇晃均匀,静置一段时间后,过0.22μm滤膜,而后将其放到冰箱中,冰箱温度为-20℃,储备起来以待日后应用。
2.2.2 制备供试品溶液。将来自于福建、广东、四川、广西、浙江、湖南等六地的药材陈皮分别放入到粉碎机中,待到粉碎结束后,再将其放入到电热恒温干燥箱中,箱中温度要达到55℃,干燥时间为6h。应用相关仪器精密称取各个产地陈皮粉碎品各2g,而后加入160μL石油醚溶液,使用超声仪器超声45min,将所有的石油醚过滤出来。待到药渣挥干后,再加入到不同容量的甲醇溶液中,分别为60μL、60μL、40μL,再进行超声提取,共3次,每次45min。完成过滤后,研究者需要将过滤液合并,待到甲醇溶液达到指定要求的200μL时,摇晃均匀,应用微孔滤膜进行过滤,最后得到了供试品溶液,将其放到冰箱中备用,冰箱温度调到-20℃。
2.3 系统适应性研究
2.3.1 研究者需要根据制备供试品溶液的步骤进行制备阴性对照液制备。
2.3.2 系统适应性。依据上述要求的色谱条件,研究将上述三种溶液进行精确提取,每个溶液各20μL。,供试品中橙皮苷与相邻杂质分离度>1.5,阴性对照溶液与橙皮苷对照品相同保留时间处未见色谱峰,认为不干扰实验测定结果。理论塔板数按照橙皮苷峰计算不低于,3000。
2.4 线性关系考察
按照对照品溶液,精密吸取对照品,溶,液,1.0μl、2.0μl、4.0μl、6.0μl、8.0μl、10.0μl、12.0μl、14.0μl、16.0μl、20.0μl,进样量为,20.0μl,不足,20μl,体积均采用流动相溶液进行补充,分别注入高效液相色谱仪器中,按照色谱条件进行测定,记录峰面积,以峰面积作为纵坐标(Y),橙皮苷进样浓度作为横坐标(X),绘制线性关系方程,得线性回归方程为:Y=1.8069×106X+1.8056×104,(r,=0.9996),,橙,皮,苷,在21.43~2143μg/μl,范围内呈良好的线性关系(这个应该没办法加入到论文中解释,根据方程可以得到一条直线,根据论文研究的需要进行橙皮苷浓度的选择,也可以选择其他浓度范围,只要是满足线性关系方程即可)。
2.5 精密度实验
精密量取橙皮苷对照品溶液20μl,连续进样,5次,按照线性关系方程计算峰面积,RSD=0.39%,表明仪器的精密度良好。
2.6 稳定性实验
精密量取供试品溶液20μl,在色谱条件下,在,0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h,内各进样,1,次测定峰面积,峰面积,RSD=1.18%,表明供试品溶液在,12h,内稳定性较好。
2.7 重复性实验
精密称取同一产地陈皮药材粗粉,5,份,按照供试品溶液的配置方法制备供品溶液,按照色谱条件下进行含量测定,橙皮苷的平均含量为4.28%,RSD=2.15%,表明测定方法的重复性较好。
2.8 加样回收率实验
精密量取,1.0μl、1.0μl、1.5μl、1.5μl、2.0μl、2.0μl,橙皮苷对照品溶液(含量约为,5.237mg/μl),置于,10μl,容量瓶中,取,6,份已知含量的供试品溶液加入不同浓度容量瓶中溶解,采用甲醇溶液稀释至刻度,分别取,20.0μl,注入高效液相色谱仪器中,按照色谱条件测定橙皮苷峰面积,计算平均回收率为98.7%。
3 讨论
3.1 選择适宜的流动相。研究过程中,研究者选择应用了甲醇、冰醋酸、水,各自比例分别为45:5:50;35:5:60,再选择一种甲醇、0.2%三氟乙酸溶液,比例为65:35。研究者从这三种流动相中选择最适宜的一种作为本试验的流动相。其中甲醇:冰醋酸:水=45:5:50,甲醇:0.2%三氟乙酸溶液等于65:35,这两种流动相样品分离效果不佳,而甲醇:冰醋酸:水=35:5:60能够将样品中的橙皮苷进行很好的分离,所以研究者选择此种流动相。
3.2 很多文献报道都采用甲醇溶液作为提取溶剂来提取橙皮苷,而橙皮苷在溶液中提取含量却非常低,为此,研究者选择其他提取溶剂,即石油醚溶液。实验表明此种提取溶剂与甲醇溶液与相比,提取效果都要好,与此同时选择应用超声仪器进行超声提取。
此次研究中选取了6个产地的陈皮,通过HPLC法测定发现,广东产地的陈皮中橙皮苷含量最高,达到了5.84%,为广西产地的橙皮苷含量最低,为3.92%。各个产地的药物陈皮橙皮苷含量都不相同,差异性明显。研究发现,HPLC法测量不同产地药材陈皮中的橙皮苷效果非常好,而且具有一定的专属性,整体操作步骤也比较简单。
参考文献
[1]苏家辉,林炳国,吴声振,张春盛.高效液相色谱法测定中药陈皮中橙皮苷的含量[J].中医临床研究,2014(12).
[2]周威,郁颖佳,谢美芬,李晓雯,李嫣,段更利.微波辅助萃取-高效液相色谱法测定陈皮中橙皮苷含量[J].医药导报,2011(5).
[3]张成川,赵颖飞,戚杏珠.高效液相色谱法测定乐清地产陈皮中橙皮苷的含量[J].海峡药学,2010(11).
[4]孙冬梅,毕晓黎,胥爱丽,庄玉坚.高效液相色谱法测定不同产地陈皮中辛弗林的含量[J].今日药学,2009(8).
关键词:HPLC法;陈皮;橙皮苷;运用
我国多地都有种植陈皮,比如福建、广东等地。陈皮是一味中草药,主要功能有理气健脾、燥湿化痰等,主要用来治疗食少吐泻、胸闷等疾病。陈皮中最重要的成分就是橙皮苷。很多研究者应用紫外分光光度法对陈皮中的橙皮苷进行检测,效果不佳,尤其表现在专属性差。有报道称,运用HPLC法测定陈皮中橙皮苷含量测量具有非常好的效果。为此本文采用HPLC法,对来自于6种不同产地的陈皮中的橙皮苷进行测定。
1 仪器与试药
1.1 仪器
美国,Discovery,C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),美国Water717,高效液相色谱仪器,紫外检测器为,SPD-10Avp,美国梅特勒-托利多,AL204,分析天平(精确度,0.0001g),郑州宏朗DZKW-D-6,型电热恒温水浴锅,济宁万和,Model,C9860A,超声波清洗脱气机器,河北,DZF-6021,型真空干燥箱。
1.2 试剂:甲醇溶液为色谱纯,冰醋酸为分析纯,水为三蒸水。
1.3 试药:橙皮苷对照组(购于中国药品生物制品检定所,批号:130825-200921),6,批不同产地陈皮药材均购于各地方的药材公司,经我当地药品检验所鉴定均为正品。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
应用Discovery C18色谱柱,将甲醇:冰醋酸:水=35:5:60,作为流动相,检测波长确定为283nm,流速确定为1.0mL/min,色谱柱温度确定为25上℃,进样量确定为20ΜL。
2.2 溶液制备
2.2.1 制备对照品溶液。运用天平称取5mg橙皮苷,该对照品必须要经过P2O5,再通过室温减压,而后再进行干燥24h才可使用,将对照品放入到25μL容量瓶中,而后添加甲醇溶液,待到指定刻度后,摇晃均匀,静置一段时间后,即得到对照品溶液。选择应用精密仪器称取对照品溶液,共5μL,而后将流动相溶液放入到25μL容量瓶中,摇晃均匀,静置一段时间后,过0.22μm滤膜,而后将其放到冰箱中,冰箱温度为-20℃,储备起来以待日后应用。
2.2.2 制备供试品溶液。将来自于福建、广东、四川、广西、浙江、湖南等六地的药材陈皮分别放入到粉碎机中,待到粉碎结束后,再将其放入到电热恒温干燥箱中,箱中温度要达到55℃,干燥时间为6h。应用相关仪器精密称取各个产地陈皮粉碎品各2g,而后加入160μL石油醚溶液,使用超声仪器超声45min,将所有的石油醚过滤出来。待到药渣挥干后,再加入到不同容量的甲醇溶液中,分别为60μL、60μL、40μL,再进行超声提取,共3次,每次45min。完成过滤后,研究者需要将过滤液合并,待到甲醇溶液达到指定要求的200μL时,摇晃均匀,应用微孔滤膜进行过滤,最后得到了供试品溶液,将其放到冰箱中备用,冰箱温度调到-20℃。
2.3 系统适应性研究
2.3.1 研究者需要根据制备供试品溶液的步骤进行制备阴性对照液制备。
2.3.2 系统适应性。依据上述要求的色谱条件,研究将上述三种溶液进行精确提取,每个溶液各20μL。,供试品中橙皮苷与相邻杂质分离度>1.5,阴性对照溶液与橙皮苷对照品相同保留时间处未见色谱峰,认为不干扰实验测定结果。理论塔板数按照橙皮苷峰计算不低于,3000。
2.4 线性关系考察
按照对照品溶液,精密吸取对照品,溶,液,1.0μl、2.0μl、4.0μl、6.0μl、8.0μl、10.0μl、12.0μl、14.0μl、16.0μl、20.0μl,进样量为,20.0μl,不足,20μl,体积均采用流动相溶液进行补充,分别注入高效液相色谱仪器中,按照色谱条件进行测定,记录峰面积,以峰面积作为纵坐标(Y),橙皮苷进样浓度作为横坐标(X),绘制线性关系方程,得线性回归方程为:Y=1.8069×106X+1.8056×104,(r,=0.9996),,橙,皮,苷,在21.43~2143μg/μl,范围内呈良好的线性关系(这个应该没办法加入到论文中解释,根据方程可以得到一条直线,根据论文研究的需要进行橙皮苷浓度的选择,也可以选择其他浓度范围,只要是满足线性关系方程即可)。
2.5 精密度实验
精密量取橙皮苷对照品溶液20μl,连续进样,5次,按照线性关系方程计算峰面积,RSD=0.39%,表明仪器的精密度良好。
2.6 稳定性实验
精密量取供试品溶液20μl,在色谱条件下,在,0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h,内各进样,1,次测定峰面积,峰面积,RSD=1.18%,表明供试品溶液在,12h,内稳定性较好。
2.7 重复性实验
精密称取同一产地陈皮药材粗粉,5,份,按照供试品溶液的配置方法制备供品溶液,按照色谱条件下进行含量测定,橙皮苷的平均含量为4.28%,RSD=2.15%,表明测定方法的重复性较好。
2.8 加样回收率实验
精密量取,1.0μl、1.0μl、1.5μl、1.5μl、2.0μl、2.0μl,橙皮苷对照品溶液(含量约为,5.237mg/μl),置于,10μl,容量瓶中,取,6,份已知含量的供试品溶液加入不同浓度容量瓶中溶解,采用甲醇溶液稀释至刻度,分别取,20.0μl,注入高效液相色谱仪器中,按照色谱条件测定橙皮苷峰面积,计算平均回收率为98.7%。
3 讨论
3.1 選择适宜的流动相。研究过程中,研究者选择应用了甲醇、冰醋酸、水,各自比例分别为45:5:50;35:5:60,再选择一种甲醇、0.2%三氟乙酸溶液,比例为65:35。研究者从这三种流动相中选择最适宜的一种作为本试验的流动相。其中甲醇:冰醋酸:水=45:5:50,甲醇:0.2%三氟乙酸溶液等于65:35,这两种流动相样品分离效果不佳,而甲醇:冰醋酸:水=35:5:60能够将样品中的橙皮苷进行很好的分离,所以研究者选择此种流动相。
3.2 很多文献报道都采用甲醇溶液作为提取溶剂来提取橙皮苷,而橙皮苷在溶液中提取含量却非常低,为此,研究者选择其他提取溶剂,即石油醚溶液。实验表明此种提取溶剂与甲醇溶液与相比,提取效果都要好,与此同时选择应用超声仪器进行超声提取。
此次研究中选取了6个产地的陈皮,通过HPLC法测定发现,广东产地的陈皮中橙皮苷含量最高,达到了5.84%,为广西产地的橙皮苷含量最低,为3.92%。各个产地的药物陈皮橙皮苷含量都不相同,差异性明显。研究发现,HPLC法测量不同产地药材陈皮中的橙皮苷效果非常好,而且具有一定的专属性,整体操作步骤也比较简单。
参考文献
[1]苏家辉,林炳国,吴声振,张春盛.高效液相色谱法测定中药陈皮中橙皮苷的含量[J].中医临床研究,2014(12).
[2]周威,郁颖佳,谢美芬,李晓雯,李嫣,段更利.微波辅助萃取-高效液相色谱法测定陈皮中橙皮苷含量[J].医药导报,2011(5).
[3]张成川,赵颖飞,戚杏珠.高效液相色谱法测定乐清地产陈皮中橙皮苷的含量[J].海峡药学,2010(11).
[4]孙冬梅,毕晓黎,胥爱丽,庄玉坚.高效液相色谱法测定不同产地陈皮中辛弗林的含量[J].今日药学,2009(8).