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中圖分类号 R285.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）01-0078-06
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.17
摘 要 目的：研究附子脂溶性生物碱对佐剂性关节炎（AIA）模型大鼠的毒性作用机制。方法：将40只大鼠随机分为空白组（超纯水）、模型组（超纯水）和附子脂溶性生物碱低、高剂量组（12.5、35 mg/kg），每组10只。除空白组外，其余各组大鼠均于右后足垫部位注射0.1 mL完全弗氏佐剂复制AIA模型。造模19 d后开始灌胃给药，每天1次。连续给药14 d后，采用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱结合高分辨质谱技术分离并鉴定血浆中内源性代谢物，然后对数据进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），通过变量投影重要度值（VIP）>1和P值（<0.05）筛选血浆中的差异代谢物；并根据差异代谢物查阅京都基因与基因组百科全书数据库，推测附子脂溶性生物碱对AIA大鼠的毒性作用机制。结果：共鉴定出57个血浆代谢物，并确定了L-脯氨酸、6-羟基烟酸、腺苷等11个差异代谢物。AIA造模后可引起大鼠血浆中L-脯氨酸和尿苷酸含量显著降低（P<0.05或P<0.01），脱氧胞苷含量显著升高（P<0.01）。低剂量附子脂溶性生物碱给药后可使模型大鼠血浆中腺苷和L-脯氨酸含量显著降低（P<0.05或P<0.01），血浆中脱氧胆酸含量显著升高（P<0.05）；而高剂量附子脂溶性生物碱给药后可使模型大鼠血浆中6-羟基烟酸、腺苷、肉碱、L-脯氨酸、N-甲酰氨基苯甲酸含量显著降低（P<0.05或P<0.01），血浆中脱氧胆酸、L-精氨酸、脱氧胞苷、L-赖氨酸含量显著升高（P<0.05或P<0.01）。结论：低剂量附子脂溶性生物碱对AIA模型大鼠的毒性较小；高剂量附子脂溶性生物碱对AIA模型大鼠的毒性作用可能与其引起胆汁分泌异常及赖氨酸生物合成及嘌呤、嘧啶、色氨酸、脯氨酸、精氨酸代谢紊乱有关。
关键词 附子；脂溶性生物碱；代谢组学；佐剂性关节炎；毒性机制；大鼠
Study on Toxicity Mechanism of Aconitum carmichaeli Lipid-soluble Alkaloids to Adjuvant-induced Arthritis Model Rats Based on Plasma Metabolomics
XIE Yunfei1，2，LI Yunxia1，LIU Meichen1，ZHOU Yimeng1，WANG Biao1，PENG Cheng1（1.School of Pharmacy， Chengdu University of TCM/Key Lab Breeding Base of Systematic Research & Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and Ministry of Science and Technology， Chengdu 611137， China；2.Dept. of Nuclear Medicine Sichuan Academy of Medical Sciences/Sichuan Provincial People’s Hospital， Chengdu 610072， China）
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the toxicity mechanism of lipid-soluble alkaloids of Aconitum carmichaeli to adjuvant-induced arthritis （AIA） model rats. METHODS： Totally 40 rats were randomly divided into blank group （ultrapure water）， model group （ultrapure water） and A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids low-dose and high-dose groups （12.5， 35 mg/kg）， with 10 rats in each group. Except for blank group， rats in other groups were given complete Freund’s adjuvant 0.1 mL on the right hind paw to induce AIA model. 19 d after modeling， they were given relevant medicine intragastrically， once a day. After 14 d of administration， endogenous metabolites were separated and identified from plasma by UPLC-LTQ/Orbitrap MS. Then， the collected data were analyzed by principal component analysis （PCA） and partial least squares-discriminant analysis （PLS-DA）. Variable importance projection （VIP）>1 and P value （<0.05） were used to screen differential metabolites in plasma. Retrieving the database of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes according to the differential metabolites，the toxic mechanism of A. carmichaeli liposoluble alkaloids to AIA rats were speculated. RESULTS： A total of 57 plasma metabolites were indentified， and 11 differential metabolites such as L-proline， 6-hydroxynicotinic acid and adenosine were identified. After inducing AIA model， the plasma contents of L-proline and uridylic acid were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， and the content of deoxycytidine was increased significantly （P<0.01）. Low dose of A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids could decrease the plasma contents of adenosine and L-proline in rats （P<0.05 or P<0.01）， while the plasma contents of deoxycholic acid was increased significantly （P<0.05）. High dose of A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids could decrease the plasma contents of 6-hydroxynicotinic acid， adenosine， carnitine， L-proline， N-formylaminobenzoic acid were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the plasma contents of deoxycholic acid， L-arginine， deoxycytidine and L-lysine were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The toxicity of low-dose of A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids to AIA model rats is less； the toxicity of high-dose of A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids to AIA model rats may be related to abnormal bile secretion， lysine biosynthesis and metabolic disorders of purine， pyrimidine， tryptophan， proline and arginine. KEYWORDS Aconitum carmichaeli； Lipid-soluble alkaloids； Metabolomics； Adjuvant-induced arthritis model； Toxic mechanism； Rat
附子为毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaeli Debx.）的子根加工品，味辛、甘，大热，有毒，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛等功效[1]。附子因含有毒性生物碱而被列入有毒中药。附子的脂溶性生物碱是其重要生物活性成分，主要由单酯二萜类乌头碱（MDAs）和双酯二萜类乌头碱（DDAs）组成[2]。附子的镇痛、抗炎和强心作用与脂溶性生物碱存在密切相关[3]。但其安全剂量狭窄，过量服用可引起胃肠道、神经和心脏毒性[4]，严重中毒者甚至在几分钟内就会死亡[5]。尽管已有通过代谢组学技术揭示乌头类植物毒性的报道，如川乌、附子炮制品（黑顺片）及乌头类生物碱毒性机制的代谢组学研究[6-9]。但多数研究仅在正常动物体中进行，缺乏对特定疾病动物模型的研究。本研究基于超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱结合高分辨质谱（UPLC-LTQ/Orbitrap MS）技术和模式识别方法，通过血浆代谢组学，研究不同剂量附子脂溶性生物碱引起的内源性代谢物的变化，以探讨其对佐剂性关节炎（AIA）模型大鼠的毒性机制，为附子用于治疗类风湿性关节炎所致的不良反应及毒性损害提供参考依据，保障其用药安全。
1 材料
1.1 仪器
ACQUITY型UPLC仪（美国Waters公司）；LTQ Orbitrap XL型质谱仪（美国Thermo公司）；KDC-2046型低速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；AL204型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。
1.2 药品与试剂
附子黑顺片炮制品（四川江油中坝附子科技发展有限公司，批号：160901，经成都中医药大学生药学教研室裴瑾教授鉴定为毛茛科植物乌头子根的黑顺片炮制品）；甲醇（上海沃凯化学试剂有限公司，批号：20180201，色谱纯）；乙腈（德国Merck公司，批号：SHBJ8804，色谱纯）；甲酸（日本TCI公司，批号：N2S2C-0G，色谱纯）；完全弗氏佐剂（美国Sigma公司，批号：SLBV6895）；水为实验室自制超纯水（Milli-Q级别）。
1.3 动物
SPF级SD大鼠40只，♀，体质量180～220 g，购自四川省中医科学院实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（川）2013-19。给予标准饮食和清洁用水，在平均温度为（20±2） ℃、相对湿度为（55±5）%条件下适应性喂养1周。
2 方法与结果
2.1 附子脂溶性生物碱的制备
取附子黑顺片炮制品5 kg并粉碎，用二氯甲烷浸润后转入5% Na2CO3溶液中浸润30 min。然后将药材转入水浴锅中，用二氯甲烷加热回流提取2次，第1次8倍量体积提取2 h，第2次6倍量体积提取1 h，水浴温度均为65 ℃。合并2次提取液，回收溶剂并浓缩至体积为2.5 L。将药液转入分液漏斗中，用0.05 mol/L H2SO4等体积萃取2次，合并萃取所得酸水液，加氨水调溶液pH至9～10，再用二氯甲烷等体积萃取3次，合并萃取液并回收二氯甲烷，得附子脂溶性生物碱约12.5 g。临用前用纯水配制成相应的浓度。
2.2 分组、造模与给药
将40只大鼠随机分为4组，分别为空白组、模型组和附子脂溶性生物碱低、高剂量组，每组10只。模型组和附子脂溶性生物碱低、高剂量组大鼠在右后足垫部位注射0.1 mL完全弗氏佐剂复制AIA模型[10]，空白组大鼠在相同部位注射0.1 mL生理盐水。大鼠造模19 d后开始给药，灌胃体积均为2 mL/100 g。经预实验，AIA模型大鼠对附子脂溶性生物碱的最大耐受剂量为35 mg/kg，故將此作为高剂量组的给药剂量，而低剂量组则选择最大耐受量的约1/3作为给药剂量，即12.5 mg/kg，空白组和模型组大鼠给予相应体积超纯水作为对照。每天1次，持续给药14 d。
2.3 血浆样本收集及处理
末次给药后2 h，所有大鼠均腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管从腹主动脉采集血液样品，并迅速转入低温离心机中，设置1 600×g离心力和4 ℃离心温度，离心15 min。然后将上清液的血浆样本转移至无菌冻存管中，液氮速冻并在-80 ℃低温冰箱中保存。
2.4 LC-MS分析系统条件
色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18 （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温为40 ℃；溶剂A为含0.1%甲酸的水，溶剂B为含0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱（0～1 min，2%B；1～9.5 min，2%→50%B；9.5～14 min，50%→98%B；14～15 min，98%B；15～15.5 min，98%→2%B；15.5～17 min，2%B）；流速为0.25 mL/min；自动进样器温度为4 ℃；进样量为5 μL。
质谱条件：质谱仪采用正（+）、负（-）离子电离模式，正离子喷雾电压为4.8 kV，负离子喷雾电压为4.5 kV，鞘气流速为45 arb，辅助气流速15 arb；毛细管温度为325 ℃；正、负离子模式下的毛细管电压为35 V/-15 V，管透镜电压为50 V/-50 V；以分辨率60 000进行全扫描，扫描范围89～1 000，采用诱导碰撞解离（CID）进行二级裂解，碰撞电压为30 eV，同时采用动态排除（重复计数为2）去除无必要的MS/MS信息，动态排除时间设置为15 s。
2.5 血浆代谢物的轮廓分析及鉴别 将血浆样本在4 ℃下融化，然后取200 μL于含有800 μL甲醇的1.5 mL离心管中，振荡60 s，混匀，在4 ℃条件下以12 000 r/min离心10 min，取上清液转移至另一1.5 mL离心管中，真空浓缩干燥后，用300 μL的80%甲醇复溶，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得待测样品。将待测样品按“2.4”项下条件进样测定，可见各组的代谢图谱均存在一定程度的差异。根据质谱中化合物的精确分子量和碎片离子信息，与常用的代谢物数据库HMDB、Metlin、Massbank等在线比对后共检测出了4 769个前体分子，并鉴定出了57个血浆代谢物。总离子流图（TIC图）见图1。
2.6 主成分分析（PCA）
作为非监督的多元分析方法，PCA可直观了解图中每个样本的空间分布，掌握各组大鼠体内代谢物的整体变化趋势。应用SIMCA-P 13.0软件（瑞典Umetrics公司）对正、负离子模式下4个血浆样品的所有变量进行PCA分析，进一步确定代谢物的差异性。结果，4个血浆样品中代谢物呈现明显的分离趋势，构建的PCA模型参数为正离子模式：R2X=0.41、负离子模式：R2X=0.49（R2X：对X轴的解释度）。PCA评分图见图2。
2.7 差异代谢物的确定及毒性相关通路分析
作为有监督的多元分析方法，偏最小二乘判别分析（PLS-DA）能进一步区分分析组的差异，并通过变量投影重要度值（VIP）确认潜在的生物标志物。应用SIMCA-P 13.0软件对实验数据进行PLS-DA分析，建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型。该模型投影中VIP>1的变量，被认为是潜在代谢生物标志物；再进一步应用SPSS 21.0软件（美国IBM公司）对筛选出的潜在代谢生物标志物进行单因素方差分析和t检验，以P<0.05为条件得出差异代谢物。
结果，各组间的代谢物可见很大程度的分离。构建的PLS-DA模型參数为正离子模式：R2X=0.364，R2Y=0.956，Q2=0.828；负离子模式：R2X=0.552，R2Y=0.986，Q2=0.791（R2Y：对Y轴的解释度，Q2：模型的预测度）。从已鉴定的57个化合物中筛选出了25个与附子脂溶性生物碱毒性相关的潜在生物标志物，并确定了其中6-羟基烟酸、腺苷、脱氧胆酸等11个差异代谢物。与空白组比较，模型组大鼠血浆中6-羟基烟酸、脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、L-精氨酸、脱氧胞苷和L-赖氨酸含量升高，尿苷酸、N-甲酰氨基苯甲酸、L-脯氨酸、肉碱和腺苷含量降低，其中L-脯氨酸、脱氧胞苷、尿苷酸差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，附子脂溶性生物碱低剂量组大鼠血浆中除脱氧胆酸含量升高外，其余10个化合物含量均降低，其中腺苷、脱氧胆酸和L-脯氨酸含量差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；附子脂溶性生物碱高剂量组大鼠血浆中5个化合物（脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、L-精氨酸、脱氧胞苷和L-赖氨酸）含量升高，其余6个化合物含量降低，且除甘氨鹅脱氧胆酸和尿苷酸外的其余9个化合物含量差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。差异代谢物通过查阅京都基因与基因组百科全书（KEGG）等在线数据库，确认其主要涉及脂肪、胆汁酸、氨基酸、能量和嘧啶代谢。PLS-DA评分图见图3，潜在生物标志物鉴定结果见表1，毒性机制关联图见图4。
3 讨论
代谢组学可对机体内源性代谢物及其变化进行快速识别和定量分析，探索代谢物变化与生理病理变化的直接关系[11]。本研究基于UPLC-LTQ/Orbitrap MS的代谢组分析技术，研究了不同剂量的附子脂溶性生物碱给药后AIA模型大鼠血浆中内源性代谢物的变化，以揭示附子脂溶性生物碱在AIA模型大鼠用药过程中所产生的相关毒性作用机制。并且通过对实验数据的多元统计分析，共筛选出了11种与附子脂溶性生物碱毒性相关的差异代谢物，并分析了可能的毒性作用机制。
3.1 胆汁酸代谢异常
在长链脂肪酸的线粒体穿梭中，肉碱作为重要的中间体，全程参与脂肪酸的转运[12]。在本研究中，附子脂溶性生物碱高剂量组大鼠血浆中肉碱含量较空白组和模型组均明显降低，这提示附子脂溶性生物碱的毒性剂量（高剂量）破坏了肉碱的平衡，可能导致脂肪酸代谢的紊乱。脱氧胆酸是一种游离胆汁酸，在肝损伤情况下，由于肝内胆汁酸的合成、清除及肠吸收受到干扰，可导致血浆中胆汁酸水平升高[13]。甘氨鹅脱氧胆酸参与初级胆汁酸生物合成，是毒性最大的胆汁酸之一，其可诱导肝细胞凋亡和胆道上皮细胞损伤[14-15]。本研究结果显示，附子脂溶性生物碱低、高剂量组大鼠血浆中脱氧胆酸水平较模型组显著升高，高剂量组升高程度较低剂量组更为明显，且高剂量组大鼠血浆中甘氨鹅脱氧胆酸的水平也有一定程度的上调。该结果表明，附子脂溶性生物碱可引起肝损伤和胆汁酸代谢紊乱，且损伤程度与用药剂量呈正相关。
3.2 氨基酸代谢异常
N-甲酰氨基苯甲酸是色氨酸通过尿氨酸途径的代谢产物，其可进一步转化为喹啉酸进入色氨酸-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸途径或转化为乙酰辅酶A，参与三羧酸循环[16]。喹啉酸可进一步代谢为烟酸，并降解为6-羟基烟酸[17]。本研究结果显示，附子脂溶性生物碱高剂量组大鼠血浆中N-甲酰氨基苯甲酸和6-羟基烟酸水平明显降低，这表明附子脂溶性生物碱的毒性剂量可能导致色氨酸代谢途径的紊乱。
在肝中，精氨酸在鸟氨酸循环中被水解，形成的鸟氨酸随后可转化为脯氨酸和多胺，其代谢产生的尿素由肾脏排出体外[18]。研究表明，赖氨酸和精氨酸在肠黏膜由同一载体运输，且在肾小管也被相同的载体转运[19]。赖氨酸与精氨酸由于存在竞争性的细胞内转运，所以过量的赖氨酸可能间接影响精氨酸的代谢[20]。本研究结果显示，附子脂溶性生物碱高剂量组大鼠血浆中L-精氨酸和L-赖氨酸水平较模型组显著升高，这表明附子脂溶性生物碱的毒性剂量可引起肝脏中部分氨基酸的代谢紊乱，而赖氨酸与精氨酸的代谢紊乱也相互作用。模型组以及附子脂溶性生物碱低、高剂量组大鼠血浆中L-脯氨酸水平较空白组均显著降低，且给药组的降低程度更为显著，这表明AIA模型大鼠由于自身疾病原因而造成脯氨酸代谢紊乱，而附子脂溶性生物碱给药后能加重脯氨酸的代谢紊乱程度。 3.3 能量代谢异常
腺苷是合成腺苷酸、腺嘌呤和三磷酸腺苷的必需中间体[21]。本研究结果显示，给药组大鼠血浆中腺苷水平较模型组显著降低，这表明附子脂溶性生物碱可能干扰了腺苷代谢而直接影响到机体的能量代谢。
3.4 嘧啶代谢异常
尿苷酸是脱氧胞苷的中间体，而脱氧胞苷是DNA链形成的必需成分。DNA的氧化损伤可能导致体内脱氧胞苷水平的异常[22]。本研究结果显示，模型组和附子脂溶性生物碱高剂量组大鼠血浆中尿苷酸水平较空白组显著降低，而脱氧胞苷水平较空白组显著升高，均表明AIA模型大鼠由于自身疾病原因可能导致了DNA的损伤，而附子脂溶性生物碱的毒性劑量不仅无法缓解，还会加重其DNA损伤，导致嘧啶代谢紊乱。
综上所述，对11种差异代谢物的分析表明，附子脂溶性生物碱的毒性剂量可引起胆汁分泌异常、赖氨酸生物合成和嘌呤、嘧啶、色氨酸、脯氨酸、精氨酸代谢的紊乱，大多数内源性代谢物的改变与药物诱导的肝损伤密切相关。该实验结果为揭示附子治疗AIA过程中所产生的毒性机制提供了参考依据，但后续研究需配合相关实验进一步完善并加以佐证。
参考文献
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（收稿日期：2018-08-23 修回日期：2018-11-11）
（編辑：林 静）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.17
摘 要 目的：研究附子脂溶性生物碱对佐剂性关节炎（AIA）模型大鼠的毒性作用机制。方法：将40只大鼠随机分为空白组（超纯水）、模型组（超纯水）和附子脂溶性生物碱低、高剂量组（12.5、35 mg/kg），每组10只。除空白组外，其余各组大鼠均于右后足垫部位注射0.1 mL完全弗氏佐剂复制AIA模型。造模19 d后开始灌胃给药，每天1次。连续给药14 d后，采用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱结合高分辨质谱技术分离并鉴定血浆中内源性代谢物，然后对数据进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），通过变量投影重要度值（VIP）>1和P值（<0.05）筛选血浆中的差异代谢物；并根据差异代谢物查阅京都基因与基因组百科全书数据库，推测附子脂溶性生物碱对AIA大鼠的毒性作用机制。结果：共鉴定出57个血浆代谢物，并确定了L-脯氨酸、6-羟基烟酸、腺苷等11个差异代谢物。AIA造模后可引起大鼠血浆中L-脯氨酸和尿苷酸含量显著降低（P<0.05或P<0.01），脱氧胞苷含量显著升高（P<0.01）。低剂量附子脂溶性生物碱给药后可使模型大鼠血浆中腺苷和L-脯氨酸含量显著降低（P<0.05或P<0.01），血浆中脱氧胆酸含量显著升高（P<0.05）；而高剂量附子脂溶性生物碱给药后可使模型大鼠血浆中6-羟基烟酸、腺苷、肉碱、L-脯氨酸、N-甲酰氨基苯甲酸含量显著降低（P<0.05或P<0.01），血浆中脱氧胆酸、L-精氨酸、脱氧胞苷、L-赖氨酸含量显著升高（P<0.05或P<0.01）。结论：低剂量附子脂溶性生物碱对AIA模型大鼠的毒性较小；高剂量附子脂溶性生物碱对AIA模型大鼠的毒性作用可能与其引起胆汁分泌异常及赖氨酸生物合成及嘌呤、嘧啶、色氨酸、脯氨酸、精氨酸代谢紊乱有关。
关键词 附子；脂溶性生物碱；代谢组学；佐剂性关节炎；毒性机制；大鼠
Study on Toxicity Mechanism of Aconitum carmichaeli Lipid-soluble Alkaloids to Adjuvant-induced Arthritis Model Rats Based on Plasma Metabolomics
XIE Yunfei1，2，LI Yunxia1，LIU Meichen1，ZHOU Yimeng1，WANG Biao1，PENG Cheng1（1.School of Pharmacy， Chengdu University of TCM/Key Lab Breeding Base of Systematic Research & Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and Ministry of Science and Technology， Chengdu 611137， China；2.Dept. of Nuclear Medicine Sichuan Academy of Medical Sciences/Sichuan Provincial People’s Hospital， Chengdu 610072， China）
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the toxicity mechanism of lipid-soluble alkaloids of Aconitum carmichaeli to adjuvant-induced arthritis （AIA） model rats. METHODS： Totally 40 rats were randomly divided into blank group （ultrapure water）， model group （ultrapure water） and A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids low-dose and high-dose groups （12.5， 35 mg/kg）， with 10 rats in each group. Except for blank group， rats in other groups were given complete Freund’s adjuvant 0.1 mL on the right hind paw to induce AIA model. 19 d after modeling， they were given relevant medicine intragastrically， once a day. After 14 d of administration， endogenous metabolites were separated and identified from plasma by UPLC-LTQ/Orbitrap MS. Then， the collected data were analyzed by principal component analysis （PCA） and partial least squares-discriminant analysis （PLS-DA）. Variable importance projection （VIP）>1 and P value （<0.05） were used to screen differential metabolites in plasma. Retrieving the database of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes according to the differential metabolites，the toxic mechanism of A. carmichaeli liposoluble alkaloids to AIA rats were speculated. RESULTS： A total of 57 plasma metabolites were indentified， and 11 differential metabolites such as L-proline， 6-hydroxynicotinic acid and adenosine were identified. After inducing AIA model， the plasma contents of L-proline and uridylic acid were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， and the content of deoxycytidine was increased significantly （P<0.01）. Low dose of A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids could decrease the plasma contents of adenosine and L-proline in rats （P<0.05 or P<0.01）， while the plasma contents of deoxycholic acid was increased significantly （P<0.05）. High dose of A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids could decrease the plasma contents of 6-hydroxynicotinic acid， adenosine， carnitine， L-proline， N-formylaminobenzoic acid were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the plasma contents of deoxycholic acid， L-arginine， deoxycytidine and L-lysine were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The toxicity of low-dose of A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids to AIA model rats is less； the toxicity of high-dose of A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids to AIA model rats may be related to abnormal bile secretion， lysine biosynthesis and metabolic disorders of purine， pyrimidine， tryptophan， proline and arginine. KEYWORDS Aconitum carmichaeli； Lipid-soluble alkaloids； Metabolomics； Adjuvant-induced arthritis model； Toxic mechanism； Rat
附子为毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaeli Debx.）的子根加工品，味辛、甘，大热，有毒，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛等功效[1]。附子因含有毒性生物碱而被列入有毒中药。附子的脂溶性生物碱是其重要生物活性成分，主要由单酯二萜类乌头碱（MDAs）和双酯二萜类乌头碱（DDAs）组成[2]。附子的镇痛、抗炎和强心作用与脂溶性生物碱存在密切相关[3]。但其安全剂量狭窄，过量服用可引起胃肠道、神经和心脏毒性[4]，严重中毒者甚至在几分钟内就会死亡[5]。尽管已有通过代谢组学技术揭示乌头类植物毒性的报道，如川乌、附子炮制品（黑顺片）及乌头类生物碱毒性机制的代谢组学研究[6-9]。但多数研究仅在正常动物体中进行，缺乏对特定疾病动物模型的研究。本研究基于超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱结合高分辨质谱（UPLC-LTQ/Orbitrap MS）技术和模式识别方法，通过血浆代谢组学，研究不同剂量附子脂溶性生物碱引起的内源性代谢物的变化，以探讨其对佐剂性关节炎（AIA）模型大鼠的毒性机制，为附子用于治疗类风湿性关节炎所致的不良反应及毒性损害提供参考依据，保障其用药安全。
1 材料
1.1 仪器
ACQUITY型UPLC仪（美国Waters公司）；LTQ Orbitrap XL型质谱仪（美国Thermo公司）；KDC-2046型低速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；AL204型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。
1.2 药品与试剂
附子黑顺片炮制品（四川江油中坝附子科技发展有限公司，批号：160901，经成都中医药大学生药学教研室裴瑾教授鉴定为毛茛科植物乌头子根的黑顺片炮制品）；甲醇（上海沃凯化学试剂有限公司，批号：20180201，色谱纯）；乙腈（德国Merck公司，批号：SHBJ8804，色谱纯）；甲酸（日本TCI公司，批号：N2S2C-0G，色谱纯）；完全弗氏佐剂（美国Sigma公司，批号：SLBV6895）；水为实验室自制超纯水（Milli-Q级别）。
1.3 动物
SPF级SD大鼠40只，♀，体质量180～220 g，购自四川省中医科学院实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（川）2013-19。给予标准饮食和清洁用水，在平均温度为（20±2） ℃、相对湿度为（55±5）%条件下适应性喂养1周。
2 方法与结果
2.1 附子脂溶性生物碱的制备
取附子黑顺片炮制品5 kg并粉碎，用二氯甲烷浸润后转入5% Na2CO3溶液中浸润30 min。然后将药材转入水浴锅中，用二氯甲烷加热回流提取2次，第1次8倍量体积提取2 h，第2次6倍量体积提取1 h，水浴温度均为65 ℃。合并2次提取液，回收溶剂并浓缩至体积为2.5 L。将药液转入分液漏斗中，用0.05 mol/L H2SO4等体积萃取2次，合并萃取所得酸水液，加氨水调溶液pH至9～10，再用二氯甲烷等体积萃取3次，合并萃取液并回收二氯甲烷，得附子脂溶性生物碱约12.5 g。临用前用纯水配制成相应的浓度。
2.2 分组、造模与给药
将40只大鼠随机分为4组，分别为空白组、模型组和附子脂溶性生物碱低、高剂量组，每组10只。模型组和附子脂溶性生物碱低、高剂量组大鼠在右后足垫部位注射0.1 mL完全弗氏佐剂复制AIA模型[10]，空白组大鼠在相同部位注射0.1 mL生理盐水。大鼠造模19 d后开始给药，灌胃体积均为2 mL/100 g。经预实验，AIA模型大鼠对附子脂溶性生物碱的最大耐受剂量为35 mg/kg，故將此作为高剂量组的给药剂量，而低剂量组则选择最大耐受量的约1/3作为给药剂量，即12.5 mg/kg，空白组和模型组大鼠给予相应体积超纯水作为对照。每天1次，持续给药14 d。
2.3 血浆样本收集及处理
末次给药后2 h，所有大鼠均腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管从腹主动脉采集血液样品，并迅速转入低温离心机中，设置1 600×g离心力和4 ℃离心温度，离心15 min。然后将上清液的血浆样本转移至无菌冻存管中，液氮速冻并在-80 ℃低温冰箱中保存。
2.4 LC-MS分析系统条件
色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18 （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温为40 ℃；溶剂A为含0.1%甲酸的水，溶剂B为含0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱（0～1 min，2%B；1～9.5 min，2%→50%B；9.5～14 min，50%→98%B；14～15 min，98%B；15～15.5 min，98%→2%B；15.5～17 min，2%B）；流速为0.25 mL/min；自动进样器温度为4 ℃；进样量为5 μL。
质谱条件：质谱仪采用正（+）、负（-）离子电离模式，正离子喷雾电压为4.8 kV，负离子喷雾电压为4.5 kV，鞘气流速为45 arb，辅助气流速15 arb；毛细管温度为325 ℃；正、负离子模式下的毛细管电压为35 V/-15 V，管透镜电压为50 V/-50 V；以分辨率60 000进行全扫描，扫描范围89～1 000，采用诱导碰撞解离（CID）进行二级裂解，碰撞电压为30 eV，同时采用动态排除（重复计数为2）去除无必要的MS/MS信息，动态排除时间设置为15 s。
2.5 血浆代谢物的轮廓分析及鉴别 将血浆样本在4 ℃下融化，然后取200 μL于含有800 μL甲醇的1.5 mL离心管中，振荡60 s，混匀，在4 ℃条件下以12 000 r/min离心10 min，取上清液转移至另一1.5 mL离心管中，真空浓缩干燥后，用300 μL的80%甲醇复溶，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得待测样品。将待测样品按“2.4”项下条件进样测定，可见各组的代谢图谱均存在一定程度的差异。根据质谱中化合物的精确分子量和碎片离子信息，与常用的代谢物数据库HMDB、Metlin、Massbank等在线比对后共检测出了4 769个前体分子，并鉴定出了57个血浆代谢物。总离子流图（TIC图）见图1。
2.6 主成分分析（PCA）
作为非监督的多元分析方法，PCA可直观了解图中每个样本的空间分布，掌握各组大鼠体内代谢物的整体变化趋势。应用SIMCA-P 13.0软件（瑞典Umetrics公司）对正、负离子模式下4个血浆样品的所有变量进行PCA分析，进一步确定代谢物的差异性。结果，4个血浆样品中代谢物呈现明显的分离趋势，构建的PCA模型参数为正离子模式：R2X=0.41、负离子模式：R2X=0.49（R2X：对X轴的解释度）。PCA评分图见图2。
2.7 差异代谢物的确定及毒性相关通路分析
作为有监督的多元分析方法，偏最小二乘判别分析（PLS-DA）能进一步区分分析组的差异，并通过变量投影重要度值（VIP）确认潜在的生物标志物。应用SIMCA-P 13.0软件对实验数据进行PLS-DA分析，建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型。该模型投影中VIP>1的变量，被认为是潜在代谢生物标志物；再进一步应用SPSS 21.0软件（美国IBM公司）对筛选出的潜在代谢生物标志物进行单因素方差分析和t检验，以P<0.05为条件得出差异代谢物。
结果，各组间的代谢物可见很大程度的分离。构建的PLS-DA模型參数为正离子模式：R2X=0.364，R2Y=0.956，Q2=0.828；负离子模式：R2X=0.552，R2Y=0.986，Q2=0.791（R2Y：对Y轴的解释度，Q2：模型的预测度）。从已鉴定的57个化合物中筛选出了25个与附子脂溶性生物碱毒性相关的潜在生物标志物，并确定了其中6-羟基烟酸、腺苷、脱氧胆酸等11个差异代谢物。与空白组比较，模型组大鼠血浆中6-羟基烟酸、脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、L-精氨酸、脱氧胞苷和L-赖氨酸含量升高，尿苷酸、N-甲酰氨基苯甲酸、L-脯氨酸、肉碱和腺苷含量降低，其中L-脯氨酸、脱氧胞苷、尿苷酸差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，附子脂溶性生物碱低剂量组大鼠血浆中除脱氧胆酸含量升高外，其余10个化合物含量均降低，其中腺苷、脱氧胆酸和L-脯氨酸含量差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；附子脂溶性生物碱高剂量组大鼠血浆中5个化合物（脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、L-精氨酸、脱氧胞苷和L-赖氨酸）含量升高，其余6个化合物含量降低，且除甘氨鹅脱氧胆酸和尿苷酸外的其余9个化合物含量差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。差异代谢物通过查阅京都基因与基因组百科全书（KEGG）等在线数据库，确认其主要涉及脂肪、胆汁酸、氨基酸、能量和嘧啶代谢。PLS-DA评分图见图3，潜在生物标志物鉴定结果见表1，毒性机制关联图见图4。
3 讨论
代谢组学可对机体内源性代谢物及其变化进行快速识别和定量分析，探索代谢物变化与生理病理变化的直接关系[11]。本研究基于UPLC-LTQ/Orbitrap MS的代谢组分析技术，研究了不同剂量的附子脂溶性生物碱给药后AIA模型大鼠血浆中内源性代谢物的变化，以揭示附子脂溶性生物碱在AIA模型大鼠用药过程中所产生的相关毒性作用机制。并且通过对实验数据的多元统计分析，共筛选出了11种与附子脂溶性生物碱毒性相关的差异代谢物，并分析了可能的毒性作用机制。
3.1 胆汁酸代谢异常
在长链脂肪酸的线粒体穿梭中，肉碱作为重要的中间体，全程参与脂肪酸的转运[12]。在本研究中，附子脂溶性生物碱高剂量组大鼠血浆中肉碱含量较空白组和模型组均明显降低，这提示附子脂溶性生物碱的毒性剂量（高剂量）破坏了肉碱的平衡，可能导致脂肪酸代谢的紊乱。脱氧胆酸是一种游离胆汁酸，在肝损伤情况下，由于肝内胆汁酸的合成、清除及肠吸收受到干扰，可导致血浆中胆汁酸水平升高[13]。甘氨鹅脱氧胆酸参与初级胆汁酸生物合成，是毒性最大的胆汁酸之一，其可诱导肝细胞凋亡和胆道上皮细胞损伤[14-15]。本研究结果显示，附子脂溶性生物碱低、高剂量组大鼠血浆中脱氧胆酸水平较模型组显著升高，高剂量组升高程度较低剂量组更为明显，且高剂量组大鼠血浆中甘氨鹅脱氧胆酸的水平也有一定程度的上调。该结果表明，附子脂溶性生物碱可引起肝损伤和胆汁酸代谢紊乱，且损伤程度与用药剂量呈正相关。
3.2 氨基酸代谢异常
N-甲酰氨基苯甲酸是色氨酸通过尿氨酸途径的代谢产物，其可进一步转化为喹啉酸进入色氨酸-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸途径或转化为乙酰辅酶A，参与三羧酸循环[16]。喹啉酸可进一步代谢为烟酸，并降解为6-羟基烟酸[17]。本研究结果显示，附子脂溶性生物碱高剂量组大鼠血浆中N-甲酰氨基苯甲酸和6-羟基烟酸水平明显降低，这表明附子脂溶性生物碱的毒性剂量可能导致色氨酸代谢途径的紊乱。
在肝中，精氨酸在鸟氨酸循环中被水解，形成的鸟氨酸随后可转化为脯氨酸和多胺，其代谢产生的尿素由肾脏排出体外[18]。研究表明，赖氨酸和精氨酸在肠黏膜由同一载体运输，且在肾小管也被相同的载体转运[19]。赖氨酸与精氨酸由于存在竞争性的细胞内转运，所以过量的赖氨酸可能间接影响精氨酸的代谢[20]。本研究结果显示，附子脂溶性生物碱高剂量组大鼠血浆中L-精氨酸和L-赖氨酸水平较模型组显著升高，这表明附子脂溶性生物碱的毒性剂量可引起肝脏中部分氨基酸的代谢紊乱，而赖氨酸与精氨酸的代谢紊乱也相互作用。模型组以及附子脂溶性生物碱低、高剂量组大鼠血浆中L-脯氨酸水平较空白组均显著降低，且给药组的降低程度更为显著，这表明AIA模型大鼠由于自身疾病原因而造成脯氨酸代谢紊乱，而附子脂溶性生物碱给药后能加重脯氨酸的代谢紊乱程度。 3.3 能量代谢异常
腺苷是合成腺苷酸、腺嘌呤和三磷酸腺苷的必需中间体[21]。本研究结果显示，给药组大鼠血浆中腺苷水平较模型组显著降低，这表明附子脂溶性生物碱可能干扰了腺苷代谢而直接影响到机体的能量代谢。
3.4 嘧啶代谢异常
尿苷酸是脱氧胞苷的中间体，而脱氧胞苷是DNA链形成的必需成分。DNA的氧化损伤可能导致体内脱氧胞苷水平的异常[22]。本研究结果显示，模型组和附子脂溶性生物碱高剂量组大鼠血浆中尿苷酸水平较空白组显著降低，而脱氧胞苷水平较空白组显著升高，均表明AIA模型大鼠由于自身疾病原因可能导致了DNA的损伤，而附子脂溶性生物碱的毒性劑量不仅无法缓解，还会加重其DNA损伤，导致嘧啶代谢紊乱。
综上所述，对11种差异代谢物的分析表明，附子脂溶性生物碱的毒性剂量可引起胆汁分泌异常、赖氨酸生物合成和嘌呤、嘧啶、色氨酸、脯氨酸、精氨酸代谢的紊乱，大多数内源性代谢物的改变与药物诱导的肝损伤密切相关。该实验结果为揭示附子治疗AIA过程中所产生的毒性机制提供了参考依据，但后续研究需配合相关实验进一步完善并加以佐证。
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（收稿日期：2018-08-23 修回日期：2018-11-11）
（編辑：林 静）