黄曲霉毒素是寄生曲霉、模式曲酶以及黄曲霉在一定温度条件下形成的真菌毒素，其对人体有较强的致癌性、致病性，同时也是严重的真菌毒素，B1、B2、G1、G2是污染粮食的重要黄曲霉毒素成分。根据我国有关规定，玉米、玉米面和玉米制品中，AFB1含量最高为20ug/kg。当前，对于黄曲霉毒素的检测方法包括薄层色谱法、酶联免疫法、胶体金试纸条法、液相色谱法、液质联用法等，但这些方法都各有优缺点。本研究结合免疫亲和净化，能够基于高效液相色谱分离技术，构建微进量小、分离度较高、无需衍生的快速黄曲霉毒素定量、定性分析法。
　　一、材料与方法
　　1.仪器与材料。高效液相色谱仪，日本岛津生产的NexeraUHPLC L-3a荧光检测器；黄曲霉毒素免疫亲和柱；玻璃纤维滤纸；0.22um有机滤膜；6位泵流操作架；电子分析天平；氮吹仪；超纯水机；黄曲霉毒素样品标准品；色谱纯级别的甲醇溶液。
　　2.设置分析条件。本研究采用的色谱柱为C18柱。流动相为45：55，甲醇水溶液流速设置为每分钟0.2mL，进样量为2uL，柱温设置为30℃，激发波长和发射波长分别为360nm和440nm。
　　3.样品制备。首先，配置标准溶液。将黄曲霉毒素混标分别配置为B1浓度：2.0、10.0、5.0、20.0、50.0ng/mL，B2和G2的浓度为：0.48、1.20、2.40、4.80、12.00ng/mL，G1的浓度为：1.12、2.80、5.6、11.2、28ng/mL。
　　二、研究结果
　　下图为黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的保留时间，其分别为4.003分钟、3.176分钟、2.533分鐘、2.052分钟，所有峰走完后全程需5分钟。


　　按照液相色谱法流动相中甲醇和水的比例为45：55、流速为0.8-1mL/min、出峰时间为15分钟，检测一个样品需消耗色谱级甲醇5.4-6.75mL。而采用高效液相色谱进行检测时，甲醇使用体积为0.45mL，相比国标方法可缩短检测时间，减少有机溶剂的使用。
　　根据研究可以发现，在高效液相色谱中进行4种毒素检测，其具有良好的线性关系，并且相关系数为0.9997，是符合样品定量要求的。结合标准曲线最低点进行仪器灵敏度的计算，通过液相色谱工作站进行信噪比、仪器检出限、定量限测定，如下表所示。


　　根据国标中黄曲霉毒素测定，采用免疫亲和净化的方式，使用普通HPLC分离柱后，碘溶液衍生荧光检测玉米中黄曲霉毒素，其AFB1检出限为100ug/kg。而本研究采用高效液相色谱进行检测时，无需衍生，并且灵敏度可提高两倍，其余黄曲霉毒素灵敏度也显著提高。按照上述方法进行空白样品加标，如下图所示，为玉米样品的加标色谱图。根据该结果可以发现，加标实验回收率达93.9%-104%，是符合国标中玉米样品回收率80%-120%要求的。


　　总之，本文构建了超高效液相色谱测定玉米中黄曲霉毒素的方法，通过研究发现，本研究具有良好的线性，且相关系数为0.9997，剂量为UL，样品加标回收率达93.9%-104.4%，相比普通液相色谱法来说，无需经过衍生处理，能够节约检测的时间，减少有机溶剂的使用量，操作相对简单、灵敏度较高，可用于粮食中黄曲霉毒素的快速测定。