【摘 要】
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目的研究抑癌microRNA(Let-7a)在Ewing肉瘤细胞系中的靶基因。方法用Northern blot分析细胞系中Let-7a的表达量;构建p MIR-reporter-CDK6野生型(CDK6_WT)或突变型(CDK6_MUT)
【机 构】
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景德镇市第一人民医院骨科,中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室
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目的研究抑癌microRNA(Let-7a)在Ewing肉瘤细胞系中的靶基因。方法用Northern blot分析细胞系中Let-7a的表达量;构建p MIR-reporter-CDK6野生型(CDK6_WT)或突变型(CDK6_MUT)及阳性对照(Let-7a_PC)质粒;体外合成的寡核苷酸(Let-7a_mimic)转染Ewing肉瘤细胞系SK-ES-1,用real time PCR检测Let-7a的表达;通过生物信息软件分析、双荧光素酶报告实验和Western blot寻找并确定Let-7a的靶基因。结果 Let-7a在Ewing肉瘤细胞系中系低表达,以MSCs为参照,SK-ES-1 Let-7a/U6 snRNA灰度值最高为:0.193±0.024(P<0.05);双酶切和DNA测序鉴定质粒构建成功;在SK-ES-1细胞中成功过表达Let-7a(P<0.01);野生型CDK6(CDK6_WT)荧光素酶表达水平与对照组和突变型CDK6(CDK6_MUT)相比明显下降(P<0.05);在SK-ES-1细胞系中过表达Let-7a抑制了CDK-6 mRNA和蛋白质的表达。结论确定了抑癌microRNA(Let-7a)在Ewing肉瘤细胞系中靶基因,为进一步实验奠定了基础。
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