【摘 要】
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目的 探讨山奈酚对人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡的影响及其机制.方法 以不同浓度山奈酚作用于HepG2细胞,在不同时间采用噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测细胞存活率;采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力定量测定试剂盒检测细胞上清液LDH的活性;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;分别采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time poly
【机 构】
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100069 首都医科大学附属北京佑安医院肝病中心三科;100069 首都医科大学附属北京佑安医院北京市肝病研究所
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目的 探讨山奈酚对人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡的影响及其机制.方法 以不同浓度山奈酚作用于HepG2细胞,在不同时间采用噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测细胞存活率;采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力定量测定试剂盒检测细胞上清液LDH的活性;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;分别采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白质印迹法(western blot,WB)检测细胞凋亡途径各标志物mRNA的相对表达量及蛋白表达水平.结果 山奈酚作用于HepG2细胞24 h后,5、10、25、50和100μmol/L山奈酚组细胞存活率分别为(102.3±1.9)％、(96.1±5.3)％、(86.7±10.3)％、(79.8±8.4)％和(60.2±2.9)％,其中,50 μmol/L和100 μmol/L山奈酚组细胞存活率与溶剂对照组的(99.6±0.6)％比较,差异有统计学意义(P=0.015,P＜0.001);100 μmol/L山奈酚作用于HepG2细胞3、6、12、24h后细胞存活率分别为(99.8±4.1)％、(92.6±7.3)％、(80.2±8.0)％和(62.5±2.7)％,其中12h和24h山奈酚组与溶剂对照组的(99.6±0.4)％比较,差异有统计学意义(P=0.015,P＜0.001).5、10、25、50、100μmol/L山奈酚作用于HepG2细胞24h后,细胞上清液中LDH活力单位分别为(198.6±28.8)、(370.0±10.2)、(395.2±16.5)、(444.5±45.1)、(475.9±33.3)U,其中,10、25、50和100 μmol/L山奈酚组与溶剂对照组的(216.7±32.4)U比较,差异有统计学意义(P=0.001,P=0.001,P=0.002,P=0.001);100 μmol/L山奈酚作用于HepG2细胞3、6、12和24h后,细胞上清液中LDH活力单位分别为(236.3±47.4)、(238.7±52.0)、(311.6±50.3)、(425.4±28.4)U,与溶剂对照组的(162.3±31.9)U比较,12h和24h山奈酚组LDH活性明显升高,差异有统计学意义(P=0.012,P=0.000).5、10、25、50、100 μmol/L山奈酚作用于HepG2细胞24 h后均可诱导凋亡发生,凋亡率分别为(3.6±0.5)％、(4.7±0.3)％、(5.3±0.7)％、(10.4±0.8)％和(16.4±0.3)％,随着山奈酚浓度的升高,凋亡率随之增加,各浓度山奈酚组细胞凋亡率显著高于溶剂对照组的(1.0±0.4)％,差异有统计学意义(P=0.003,P=0.000,P=0.001,P＜0.001,P＜0.001);100 μmol/L山奈酚作用于HepG2细胞3、6、12、24 h后,细胞凋亡率分别为(4.8±0.4)％、(7.9±0.4)％、(11.4±0.5)％和(16.5±1.0)％,且各组细胞凋亡率均显著高于溶剂对照组的(0.4±0.1)％,差异有统计学意义(P均＜ 0.001).山奈酚作用于HepG2细胞后,Bax、葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78,GRP78)、葡萄糖调节蛋白94 (glucose-regulated protein 94,GRP94)、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、裂解的活化转录因子6(cleaved activating transcription factor 6,cleaved ATF6)、肌醇需求酶1α (inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)mRNA的相对表达量及裂解caspase3、caspase4蛋白表达水平随着山奈酚浓度的升高及作用时间的延长逐渐增加;各组Bcl-2 mRNA的相对表达量与溶剂对照组相比,差异无统计学意义.结论 山奈酚可以通过线粒体途径和内质网应激途径诱导HepG2细胞凋亡,可能具有潜在的抗肝癌活性.
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