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摘要：对热带洋兰叶斑病病原菌串珠镰刀菌BlOb开展了寄主范围、生物学特性研究，并对其进行了防治药剂毒力测定。结果表明：人工接种后该病原菌能侵染石斛兰、蝴蝶兰、大花蕙兰和文心兰叶片并引起典型叶斑病症状；其菌丝生长的最适温度范围为25～28℃，最适pH7～8；甘露醇、麦芽糖、可溶性淀粉是其最佳生长碳源，牛肉膏和蛋白胨是最适氮源；菌丝和孢子的致死温度为65℃ 30 min异菌脲、腈菌唑对菌丝生长的抑制作用很强，其EC50分别为1.12×10-5μg/mL和1.5254μg/mL，甲基硫菌灵和代森锰锌的效果较弱，其EC50分别为105.8798μg/mL和66.830 2μg/mL。
关键词：热带洋兰；叶斑病；生物学特性；毒力测定
中图分类号：S 436，8
热带洋兰因其经济价值较高，在南方各省广泛栽培。但其规模化生产和密集栽培，以及高温高湿的特殊培养条件有利于病原微生物大量繁殖，严重影响了兰花的生长及经济价值。热带洋兰的常见病害包括叶斑病、白绢病、黑点斑病、褐斑病、枯萎病等。其中叶斑病主要危害叶部，一般从叶尖开始发病，发病叶片的正反面、叶尖及叶边缘均可出现褐斑或黑斑。有时相邻病斑融合成大病斑，处于边缘的病斑也多连成线状，严重时叶片萎黄，目前发现危害热带洋兰的叶斑病有多种，其中以尾孢叶斑病、拟盘多毛孢叶斑病、散斑壳叶斑病和叶点霉叶斑病较为普遍。
珠海市农业科学研究中心自1999年开始规模化生产热带洋兰，在生产过程中发现了一种由串珠镰刀菌引起的热带洋兰(包括石斛兰、文心兰和大花蕙兰等)叶斑病，此病虽不能造成整株死亡，但因其极易发病，发病规模大，从而增加了洋兰生产成本，而且发病后的病斑降低了其质量和商品价值。本文针对该病原菌开展了寄主范围、生物学特性以及防治药剂毒力测定等研究，为洋兰的栽培管理和病害防治提供依据，以指导生产实践。
1、材料与方法
1.1材料
供试菌株：串珠镰刀菌B10b，分离自患病石斛兰，珠海市农业科学研究中心生物防治技术实验室保藏。
供试植物：石斛兰(熊猫一号、蝴蝶石斛、春石斛和迷你石斛)、文心兰(黄金一号)、蝴蝶兰(大红花线条)、大花蕙兰，珠海市农业科学研究中心兰花资源圃提供。
1.2病原菌的寄主范围研究
根据柯赫氏法则，采用无伤接种和致伤接种两种方式测定了病原菌孢子和菌丝体对石斛兰、文心兰、蝴蝶兰、大花蕙兰(苗龄为1～2年)的致病性。每个处理3个重复，一个重复1株苗，每株苗接种3片叶，另设两组不接菌的苗为对照。然后将各种供试兰花苗置于温度为26～29℃，相对湿度为80％～90％的温室中培养。每天观察记录其发病情况。
1.3病原菌的形态学观察
将分离得到的菌株接种于PDA平板上，28℃培养7 d后，观察菌落形态。利用载玻片培养法培养菌株，在不同培养时间取出载玻片观察菌丝和分生孢子的形态。
1.4生物学特性研究
1.4.1温度对菌丝生长的影响
用PDA平板培养病原菌7 d以活化，然后用直径为5 mm的无菌打孔器在菌落边缘打取菌块，将其接种于新鲜PDA平板中央，将平板分别置于16、20、25、28、30、35、40℃下培养，每个温度重复3次。分别在培养3 d和6 d后用十字交叉法测量菌落直径。
1.4.2 pH对菌丝生长的影响
在无菌条件下用无菌氢氧化钠(1 mol/L)和盐酸(1 mol/L)调节高压灭菌后的PDA培养基的pH为3.0、5.0、7.0、8.0、10.0和12.0，然后将直径为5 mm的菌块分别接种于不同pH的PDA平板中央，每个处理重复3次。28℃培养3 d和6 d后用十字交叉法测定菌落直径。
1.4.3不同碳、氮源对菌丝生长的影响
1.4.3.1不同碳源对菌丝生长的影响
以查彼克(Czapek)培养基为基础，用含有相当碳的不同碳源(葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、甘露醇)代替查彼克培养基中的蔗糖，配成含不同碳源的固体培养基，以不含蔗糖的查彼克固体培养基为对照，每个处理重复3次。28℃培养3 d和6 d后用十字交叉法测定菌落直径。
1.4.3.2不同氮源对菌丝生长的影响
以查彼克培养基为基础培养基，用含有相当氮的不同氮源(牛肉膏、蛋白胨、硝酸钠、甘氨酸、L—精氨酸、脲、氯化铵)代替此培养基中的硝酸钾，配成含不同氮源的固体培养基，以不含硝酸钾的查彼克培养基为对照，每个处理重复3次，28℃培养3 d和6 d后用十字交叉法测定菌落直径。
1.4.4光照对菌丝生长的影响
按1.4.1的方法将病原菌菌块接种于PDA平板上，然后分别置于：(1)8 w日光灯下连续光照；(2)12 h光暗交替；(3)连续黑暗条件下。每个处理重复3次，28℃培养3 d和6 d后用十字交叉法测量菌落直径。
1.4.5菌丝和孢子致死温度测定
1.4.5.1菌丝致死温度
将直径为5 mm的菌块分别置于已预热到45、50、55、60℃和65℃的含2 mL无菌水的小试管中，每支小试管5个菌块，然后将试管置于相应温度的水浴锅中处理30 min后，取出菌块置于PDA平板上，28℃培养14 d后观察其生长情况。
1.4.5.2孢子致死温度
分别用已预热到45、50、55、60℃和65℃的无菌水将孢子配成1.3×106个／mL的悬浮液，然后将其分别置于相应温度的水浴锅中处理30 min。每个温度3个重复，72 h后用血球计数板观察孢子萌发情况，并计算萌发率。
1.5药剂对病原菌菌丝生长的影响
采用药皿抑菌法测定供试药剂的EC50。根据毒力预备试验，将供试药剂用紫外灯照射2～3 h除菌后，用无菌水按倍数逐步稀释配成3个系列浓度，然后与50～55℃的PDA培养基混合均匀，制成不同浓度的含药平板。每皿中央接种直径为5 mm的菌块，重复3次，以不加药剂只加相同量无菌水的处理为对照。在28℃恒温培养7 d，测量菌落直径，按如下公式计算抑菌率，利用概率值法求出各药剂的毒力回归曲线，并计算EC50。
供试药剂包括70％甲基硫菌灵可湿性粉剂(甲基托布津，日本曹达株式会社)、50％代森锰锌可湿性粉剂(利民化工有限责任公司)、50％异菌脲悬浮剂(扑海因，拜耳杭州作物科学有限公司)、12.5％腈菌唑乳油(深圳诺普信农化股份有限公司)。
抑菌率计算：抑菌率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)／对照菌落直径×100％。
1.6数据分析
用SPSS(13.0)软件对数据进行方差分析，平 均值用LSD测验进行显著性差异比较(p≤0.05)，使用Excel软件获得毒力回归方程并计算EC50。
2、结果与分析
2.1病原菌的形态特征
此菌在PDA平板上菌落平坦，形成数个同心圆；培养过程中能分泌紫红色色素，平板背面紫红色；气生菌丝白色、致密、棉絮状，有隔，隔膜为双层膜，内部有较多点状内含物。瓶梗状分生孢子梗单枝或多枝。分生孢子无色，有大小两种：大型分生孢子少，微弯曲，为不对称的拟纺锤形，1个隔膜，大小为(3.96～15.3)μm×(1.32～4.95)μm；小型分生孢子卵圆形，无隔，成串或假头状。经广东微生物所鉴定为串珠镰刀菌。
2.2病原菌寄主范围
致伤与无伤2种接种方式均可引起供试洋兰发病，其中致伤接种发病较快，24 h内出现症状，72 h已形成较大病斑，直径达0.7～1 cm；无伤接种48 h后才出现几个黑色斑点，72 h后病斑增多并扩大，直径达0.1～0.3 cm；而且在这些患病叶片的病健交界处分离出与B10b相同的病原菌。结果显示，该病原菌能引起石斛兰、蝴蝶兰、文心兰和大花蕙兰等热带洋兰的叶斑病，其寄主范围较广。
2.3生物学特性
2.3.1温度对菌丝生长的影响
温度能够显著影响菌丝生长(表1)，B10b在测试温度范围内均能生长，但其最适温度范围为25～28℃，35℃及以上的温度会抑制菌丝的生长。
2.3.3碳源对菌丝生长的影响
碳源对菌株B10 b的生长有明显的影响(表3)，该菌株能在无糖培养基中生长，但对甘露醇、麦芽糖、可溶性淀粉的利用效果较好，菌丝生长较快。最初对木糖的利用效果不太好，但随着时间的推移，菌株对其的利用效果得到了提高。
染石斛兰、文心兰、蝴蝶兰和大花蕙兰，并在叶片形成黑色小斑点。通过研究该病原菌的生物学特性发现，该菌的温度适应性较广，能够在16～35℃范围内生长，最适温度范围为20～30℃，与洋兰生长的适宜温度范围吻合。B10b菌株适宜在pH7～8的偏碱性环境生长，能够利用多种碳氮源，甚至在没有碳源或氮源的条件下也能生长，黑暗交替的光照条件更适合菌株生长，这些特点表明此病原菌有较强的生存能力，对洋兰的生产具有极大的危害性。
本文选择杀菌机理不同的4种药剂开展毒力试验，其中异菌脲对本菌株的毒力最强，其EC50最小，其次是腈菌唑，但代森锰锌和甲基硫菌灵对菌株的毒力较小；研究还发现紫外线照射能够提高甲基硫菌灵的杀菌效果，但不会影响其他3种药剂的效果。异菌脲通过抑制蛋白激酶，干扰细胞内信号传导，从而抑制真菌孢子萌发、产生以及菌丝生长；腈菌唑则通过抑制麦角甾醇生物合成，从而干扰病原菌正常生长和抑制孢子形成；代森锰锌通过抑制菌体内丙酮酸的氧化以及和蛋白质体上的巯基结合达到抑菌效果，属于保护性杀菌剂；甲基硫菌灵主要影响细胞分裂从而达到抑菌的效果。显微观察不同药剂处理后的病原菌菌丝发现菌丝表现出不同的异常现象：在异菌脲和腈菌唑药皿上生长的菌丝，与正常菌丝比，表现出节状膨大，内含物较多，内含颗粒较小而且形状多变；在甲基硫菌灵药皿上的菌丝表现出分支较少，内含物形状规则，圆形，颗粒较大，成直线排列；在代森锰锌药皿上的菌丝则几乎不含内含物。不同杀菌剂对菌株的毒力效果可能与杀菌剂的作用机制密切相关，也可能与温室生产中长期使用代森锰锌和甲基硫菌灵引起菌株的抗药性有关。
关键词：热带洋兰；叶斑病；生物学特性；毒力测定
中图分类号：S 436，8
热带洋兰因其经济价值较高，在南方各省广泛栽培。但其规模化生产和密集栽培，以及高温高湿的特殊培养条件有利于病原微生物大量繁殖，严重影响了兰花的生长及经济价值。热带洋兰的常见病害包括叶斑病、白绢病、黑点斑病、褐斑病、枯萎病等。其中叶斑病主要危害叶部，一般从叶尖开始发病，发病叶片的正反面、叶尖及叶边缘均可出现褐斑或黑斑。有时相邻病斑融合成大病斑，处于边缘的病斑也多连成线状，严重时叶片萎黄，目前发现危害热带洋兰的叶斑病有多种，其中以尾孢叶斑病、拟盘多毛孢叶斑病、散斑壳叶斑病和叶点霉叶斑病较为普遍。
珠海市农业科学研究中心自1999年开始规模化生产热带洋兰，在生产过程中发现了一种由串珠镰刀菌引起的热带洋兰(包括石斛兰、文心兰和大花蕙兰等)叶斑病，此病虽不能造成整株死亡，但因其极易发病，发病规模大，从而增加了洋兰生产成本，而且发病后的病斑降低了其质量和商品价值。本文针对该病原菌开展了寄主范围、生物学特性以及防治药剂毒力测定等研究，为洋兰的栽培管理和病害防治提供依据，以指导生产实践。
1、材料与方法
1.1材料
供试菌株：串珠镰刀菌B10b，分离自患病石斛兰，珠海市农业科学研究中心生物防治技术实验室保藏。
供试植物：石斛兰(熊猫一号、蝴蝶石斛、春石斛和迷你石斛)、文心兰(黄金一号)、蝴蝶兰(大红花线条)、大花蕙兰，珠海市农业科学研究中心兰花资源圃提供。
1.2病原菌的寄主范围研究
根据柯赫氏法则，采用无伤接种和致伤接种两种方式测定了病原菌孢子和菌丝体对石斛兰、文心兰、蝴蝶兰、大花蕙兰(苗龄为1～2年)的致病性。每个处理3个重复，一个重复1株苗，每株苗接种3片叶，另设两组不接菌的苗为对照。然后将各种供试兰花苗置于温度为26～29℃，相对湿度为80％～90％的温室中培养。每天观察记录其发病情况。
1.3病原菌的形态学观察
将分离得到的菌株接种于PDA平板上，28℃培养7 d后，观察菌落形态。利用载玻片培养法培养菌株，在不同培养时间取出载玻片观察菌丝和分生孢子的形态。
1.4生物学特性研究
1.4.1温度对菌丝生长的影响
用PDA平板培养病原菌7 d以活化，然后用直径为5 mm的无菌打孔器在菌落边缘打取菌块，将其接种于新鲜PDA平板中央，将平板分别置于16、20、25、28、30、35、40℃下培养，每个温度重复3次。分别在培养3 d和6 d后用十字交叉法测量菌落直径。
1.4.2 pH对菌丝生长的影响
在无菌条件下用无菌氢氧化钠(1 mol/L)和盐酸(1 mol/L)调节高压灭菌后的PDA培养基的pH为3.0、5.0、7.0、8.0、10.0和12.0，然后将直径为5 mm的菌块分别接种于不同pH的PDA平板中央，每个处理重复3次。28℃培养3 d和6 d后用十字交叉法测定菌落直径。
1.4.3不同碳、氮源对菌丝生长的影响
1.4.3.1不同碳源对菌丝生长的影响
以查彼克(Czapek)培养基为基础，用含有相当碳的不同碳源(葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、甘露醇)代替查彼克培养基中的蔗糖，配成含不同碳源的固体培养基，以不含蔗糖的查彼克固体培养基为对照，每个处理重复3次。28℃培养3 d和6 d后用十字交叉法测定菌落直径。
1.4.3.2不同氮源对菌丝生长的影响
以查彼克培养基为基础培养基，用含有相当氮的不同氮源(牛肉膏、蛋白胨、硝酸钠、甘氨酸、L—精氨酸、脲、氯化铵)代替此培养基中的硝酸钾，配成含不同氮源的固体培养基，以不含硝酸钾的查彼克培养基为对照，每个处理重复3次，28℃培养3 d和6 d后用十字交叉法测定菌落直径。
1.4.4光照对菌丝生长的影响
按1.4.1的方法将病原菌菌块接种于PDA平板上，然后分别置于：(1)8 w日光灯下连续光照；(2)12 h光暗交替；(3)连续黑暗条件下。每个处理重复3次，28℃培养3 d和6 d后用十字交叉法测量菌落直径。
1.4.5菌丝和孢子致死温度测定
1.4.5.1菌丝致死温度
将直径为5 mm的菌块分别置于已预热到45、50、55、60℃和65℃的含2 mL无菌水的小试管中，每支小试管5个菌块，然后将试管置于相应温度的水浴锅中处理30 min后，取出菌块置于PDA平板上，28℃培养14 d后观察其生长情况。
1.4.5.2孢子致死温度
分别用已预热到45、50、55、60℃和65℃的无菌水将孢子配成1.3×106个／mL的悬浮液，然后将其分别置于相应温度的水浴锅中处理30 min。每个温度3个重复，72 h后用血球计数板观察孢子萌发情况，并计算萌发率。
1.5药剂对病原菌菌丝生长的影响
采用药皿抑菌法测定供试药剂的EC50。根据毒力预备试验，将供试药剂用紫外灯照射2～3 h除菌后，用无菌水按倍数逐步稀释配成3个系列浓度，然后与50～55℃的PDA培养基混合均匀，制成不同浓度的含药平板。每皿中央接种直径为5 mm的菌块，重复3次，以不加药剂只加相同量无菌水的处理为对照。在28℃恒温培养7 d，测量菌落直径，按如下公式计算抑菌率，利用概率值法求出各药剂的毒力回归曲线，并计算EC50。
供试药剂包括70％甲基硫菌灵可湿性粉剂(甲基托布津，日本曹达株式会社)、50％代森锰锌可湿性粉剂(利民化工有限责任公司)、50％异菌脲悬浮剂(扑海因，拜耳杭州作物科学有限公司)、12.5％腈菌唑乳油(深圳诺普信农化股份有限公司)。
抑菌率计算：抑菌率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)／对照菌落直径×100％。
1.6数据分析
用SPSS(13.0)软件对数据进行方差分析，平 均值用LSD测验进行显著性差异比较(p≤0.05)，使用Excel软件获得毒力回归方程并计算EC50。
2、结果与分析
2.1病原菌的形态特征
此菌在PDA平板上菌落平坦，形成数个同心圆；培养过程中能分泌紫红色色素，平板背面紫红色；气生菌丝白色、致密、棉絮状，有隔，隔膜为双层膜，内部有较多点状内含物。瓶梗状分生孢子梗单枝或多枝。分生孢子无色，有大小两种：大型分生孢子少，微弯曲，为不对称的拟纺锤形，1个隔膜，大小为(3.96～15.3)μm×(1.32～4.95)μm；小型分生孢子卵圆形，无隔，成串或假头状。经广东微生物所鉴定为串珠镰刀菌。
2.2病原菌寄主范围
致伤与无伤2种接种方式均可引起供试洋兰发病，其中致伤接种发病较快，24 h内出现症状，72 h已形成较大病斑，直径达0.7～1 cm；无伤接种48 h后才出现几个黑色斑点，72 h后病斑增多并扩大，直径达0.1～0.3 cm；而且在这些患病叶片的病健交界处分离出与B10b相同的病原菌。结果显示，该病原菌能引起石斛兰、蝴蝶兰、文心兰和大花蕙兰等热带洋兰的叶斑病，其寄主范围较广。
2.3生物学特性
2.3.1温度对菌丝生长的影响
温度能够显著影响菌丝生长(表1)，B10b在测试温度范围内均能生长，但其最适温度范围为25～28℃，35℃及以上的温度会抑制菌丝的生长。
2.3.3碳源对菌丝生长的影响
碳源对菌株B10 b的生长有明显的影响(表3)，该菌株能在无糖培养基中生长，但对甘露醇、麦芽糖、可溶性淀粉的利用效果较好，菌丝生长较快。最初对木糖的利用效果不太好，但随着时间的推移，菌株对其的利用效果得到了提高。
染石斛兰、文心兰、蝴蝶兰和大花蕙兰，并在叶片形成黑色小斑点。通过研究该病原菌的生物学特性发现，该菌的温度适应性较广，能够在16～35℃范围内生长，最适温度范围为20～30℃，与洋兰生长的适宜温度范围吻合。B10b菌株适宜在pH7～8的偏碱性环境生长，能够利用多种碳氮源，甚至在没有碳源或氮源的条件下也能生长，黑暗交替的光照条件更适合菌株生长，这些特点表明此病原菌有较强的生存能力，对洋兰的生产具有极大的危害性。
本文选择杀菌机理不同的4种药剂开展毒力试验，其中异菌脲对本菌株的毒力最强，其EC50最小，其次是腈菌唑，但代森锰锌和甲基硫菌灵对菌株的毒力较小；研究还发现紫外线照射能够提高甲基硫菌灵的杀菌效果，但不会影响其他3种药剂的效果。异菌脲通过抑制蛋白激酶，干扰细胞内信号传导，从而抑制真菌孢子萌发、产生以及菌丝生长；腈菌唑则通过抑制麦角甾醇生物合成，从而干扰病原菌正常生长和抑制孢子形成；代森锰锌通过抑制菌体内丙酮酸的氧化以及和蛋白质体上的巯基结合达到抑菌效果，属于保护性杀菌剂；甲基硫菌灵主要影响细胞分裂从而达到抑菌的效果。显微观察不同药剂处理后的病原菌菌丝发现菌丝表现出不同的异常现象：在异菌脲和腈菌唑药皿上生长的菌丝，与正常菌丝比，表现出节状膨大，内含物较多，内含颗粒较小而且形状多变；在甲基硫菌灵药皿上的菌丝表现出分支较少，内含物形状规则，圆形，颗粒较大，成直线排列；在代森锰锌药皿上的菌丝则几乎不含内含物。不同杀菌剂对菌株的毒力效果可能与杀菌剂的作用机制密切相关，也可能与温室生产中长期使用代森锰锌和甲基硫菌灵引起菌株的抗药性有关。