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摘 要：应用低浓度美兰染色液（2.0%）对原生动物进行梯度微麻醉，麻醉后的虫体活动性减弱但伸缩泡活动状态良好，能够较清晰的观察伸缩泡及收集管的交替活动，可计数活动频率，且这种状态的维持时间较长（约19min）。为将细胞压制为既较薄又不破碎，实验应用低浓度（1%）甲基纤维素作为支撑物，结果表明，该方法操作简单，效果较好，适用于高校或中学动物学实验的课堂操作。
关键词：原生动物；伸缩泡；收集管；美兰染色；甲基纤维素
中图分类号 Q95-33 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）19-0129-03
Improvement of the Observation Method of Contractile Vacuole of “Expansion of Protozoa” in Zoology Experimental Teaching
Guan Ping1 et al.
（1School of Biological Science and Technology， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）
Abstract：Protozoa was carried out with low concentration of methylene blue staining solution （2.0%） to be gradient micro-anesthetized.The activity of the insects after anesthesia was weakened but the activity of the contractile vacuole was good.It was possible to observe the alternating activities of the contractile vacuole and the collecting tube more clearly.The activity frequency can be counted.This state is maintained for a longer period of time （about 19minutes）.To suppress the cells to be both thin and not broken， the experiment used low concentrations （1%） of methyl cellulose as a support.This method has a simple operation and is suitable for classroom operation in laboratory experiments in middle schools or colleges.
Key words：Protozoa；Contractile vacuole；Collecting canals；Methylene blue staining；Methyl cellulose
動物学实验是高等院校普遍开设的必修课程之一，农业院校中开设动物学实验的专业更加广泛，课时较多，每个实验项目修习的内容也更加深入。“原生动物的结构观察”是动物学实验的必修科目，尾草履虫[1]是这个实验中最为常用的实验材料。农业院校畜牧兽医、生物科学和生物技术等专业对于这个实验项目的要求较高，除了常规的胞器（细胞核、食物泡和刺丝泡等）观察外，伸缩泡也是必须观察的胞器。针对该实验，许多教学和科研人员对尾草履虫细胞器的观察方法进行了改进和优化[2-3]，对细胞核、食物泡和刺丝泡等胞器均取得了较好的观察效果[5-6]。较之上述器官，伸缩泡结构复杂，动态活动性强，想在课堂较短时间内得到良好的效果略有难度。因此，探寻适用于课堂教学，利于学生操作的方法进行伸缩泡的观察，是实验指导教师和理论课授课教师一直关注的问题。本文将报道一种较为有效的观察草履虫伸缩泡动态变化过程的简易方法，供动物学实验教学人员参考。
1 材料
1.1 动物材料 尾草履虫（Paramecium caudatum）：采集于沈阳市马官桥下，培养于沈阳农业大学生物科学实验室，繁殖至150代左右且密度较大时用于本实验。
1.2 试剂 石碳酸品红溶液、美兰染液、醋酸、戊巴比妥钠、乙醇、生菜汁培养液、甲基纤维素等。
1.3 仪器和用具 恒温培养箱、体式显微镜、显微镜及摄像系统、恒温震荡器、冰箱、电子天平、微量移液器、低速离心机等。培养皿、试管、胶头滴管、微吸管、载玻片、盖玻片等。
1.4 消耗性材料 枪头、离心管、滤纸、脱脂棉等。
2 方法
2.1 尾草履虫伸缩泡观察时麻醉剂的添加及观察
将梯度浓度的5种常用化学试剂分别配制为0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%等7个梯度浓度，分别加入预先放入100只尾草履虫的厚凹片中滴加5mL，室温放置20min后，进行存活率的检测，每种试剂筛选出1个适宜的剂量，该适宜剂量应为虫体被较好的麻醉且存活率较高。在该适宜剂量的处理中吸取状态良好的个体置于显微镜下进行观察，确定伸缩泡和收集管的观察效果。
2.2 伸缩泡简易观察法 吸取尾草履虫培养液（虫体密度大时效果较好）1滴于清洁的载玻片上，待液滴稍散开时，在液滴中部滴加少许用培养液配制成的2%美兰染液。如较难控制滴加量时可用解剖针等蘸取少许染色液溶于培养液滴中部，待染色液滴稍散开但未扩散均匀时，制成草履虫临时装片。
2.3 伸缩泡观察装片盖片支撑物的选择 选择5种常用支撑物进行常规压片，对其封片和观察效果进行检测，筛选出适用于观察伸缩泡装片制作的适宜支撑物。 3 结果与分析
3.1 5种化学试剂对尾草履虫存活率的影响 根据方法2.1测定5种化学试剂（5个梯度）对尾草履虫存活率的影响，其结果如表1所示。由表1可知，5种化学试剂均得到了存活率较高的浓度，分别为1.5%石碳酸品红、2.0%的美兰染色液、0.5%的醋酸溶液、0.25%的戊巴比妥钠和0.5%的乙醇。
3.2 5种化学试剂适宜剂量处理尾草履虫后观察伸缩泡的效果 按照方法2.1筛选出适宜剂量，对适宜剂量处理的细胞进行观察，其结果如表2所示。由表2可知，2.0%的美兰染液、0.5%的醋酸溶液和0.5%的乙醇溶液处理后，可在镜下观察到伸缩泡，其中美兰染液组的伸缩泡较为清晰，收集管可见度高，收集管活动频率较易计数，本实验计数为17次/min。这种状态的维持时间为19min，对于课堂教学的观察时间较为充裕。
3.3 观察结果 根据方法2.2，应用2.0%的美兰溶液对草履虫进行处理后，置于显微镜下进行观察，观察结果表明：在镜下寻找处于不动状态但并未死亡的虫体，在细胞前后部找到伸缩泡（图1的1～3），此时将物镜转为高倍进行仔细观察，可清晰的看到伸缩泡和收集管的交替活动（图1的4～6）。滴加染色液后待液滴未均匀时进行压片可在小范围内形成1个剂量梯度，剂量大的位置虫体被较深麻醉甚至杀死，剂量较小的位置虫体麻醉程度小或仍可处于自由活动状态，这2种状态均不利于伸缩泡的观察，但这2种状态的中间位置可找到虫体处于适度麻醉而胞器活动正常的个体。装片制成片刻后，美兰染色液即可适量渗入伸缩泡，在显微镜下呈现极浅的蓝色，将视野略加调暗，观察效果十分理想。此种方法观察伸缩泡正常活动时程较长，可达20min以上，适于实验课堂操作。时间过久后染色液逐渐扩散均匀导致伸缩泡过度膨胀，最终解体。
3.4 4种临时装片支撑物的使用结果 根据方法2.3选取5种盖玻片支撑物，制作临时装片后，对支撑物的效果进行检测，其结果如表1所示。由表3可知：支撑力较强的尾棉花和10%甲基纤维素；甲基纤维素的溶解速度较胶水和浆糊慢；盖片距离的精确控制力方面仅有10%的甲基纤维素效果最好。
4 讨论
原生动物为实验教学和科学研究中常用的实验动物，尾草履虫作为常规实验教学的材料具有较多优势：易于采集和培养，细胞核小核个体大，染色和观察操作简单等。伸缩泡是原生动物的重要胞器，行使水分调节和代谢废物的排出等功能，为使理论课堂的知识得以巩固，实验教学中应进行更详细的观察和讲解，但伸缩泡的观察效果一直不尽人意，尤其是实验课堂时间短，学生操作不熟练等。伸缩泡未能得到较好观察的主要原因如下：（1）该细胞器为膜泡状组成，在活体中不易观察；（2）活动的规律性较强，如用一般染料进行固定后观察不到其动态过程；（3）位置深埋于细胞质中。为使学生更好地掌握这个器官的特点，本实验专门针对该问题进行了探讨，寻找出一种较为适用于课堂的观察方法，将细胞处理后处于既未死亡又不运动的麻醉状态进行观察，应用美兰染色液处理效果比較理想。该方法得以成功使用的前提是具备一定的临时装片制备技术，尤其是盖玻片支撑物的选择，10%的甲基纤维较为适用。
参考文献
[1]李力，谢娟英.培养液对尾草履虫种群增长和个体形态的影响[J].西北大学学报，2004，3：314-316.
[2]杨仙玉.教学中草履虫活体观察方法[J].中国科教创新导刊，2010，2：88-89.
[3]唐发辉，赵元莙，汪婷.食物泡在草履虫体内移行现象与伸缩泡频率的相关研究分析[J].教育教学论坛，2015，8：67-68.
[4]J.Venkateswara Rao，S.K.Arepalli，V.G.Gunda，et al.Assessment of cytoskeletal damage in Paramecium caudatum：An early warning system for apoptotic studies[J].Protist，2018，6：205-219.
[5]高晶.尾草履虫、尾柱虫和魏氏拟尾柱虫形态、细胞内部及表膜下结构的观察[D].哈尔滨：哈尔滨师范大学，2012.
[6]杨仙玉.观察草履虫细胞核的两种染色方法[J].科技创新导报，2010，3：240.
（责编：张宏民）
关键词：原生动物；伸缩泡；收集管；美兰染色；甲基纤维素
中图分类号 Q95-33 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）19-0129-03
Improvement of the Observation Method of Contractile Vacuole of “Expansion of Protozoa” in Zoology Experimental Teaching
Guan Ping1 et al.
（1School of Biological Science and Technology， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）
Abstract：Protozoa was carried out with low concentration of methylene blue staining solution （2.0%） to be gradient micro-anesthetized.The activity of the insects after anesthesia was weakened but the activity of the contractile vacuole was good.It was possible to observe the alternating activities of the contractile vacuole and the collecting tube more clearly.The activity frequency can be counted.This state is maintained for a longer period of time （about 19minutes）.To suppress the cells to be both thin and not broken， the experiment used low concentrations （1%） of methyl cellulose as a support.This method has a simple operation and is suitable for classroom operation in laboratory experiments in middle schools or colleges.
Key words：Protozoa；Contractile vacuole；Collecting canals；Methylene blue staining；Methyl cellulose
動物学实验是高等院校普遍开设的必修课程之一，农业院校中开设动物学实验的专业更加广泛，课时较多，每个实验项目修习的内容也更加深入。“原生动物的结构观察”是动物学实验的必修科目，尾草履虫[1]是这个实验中最为常用的实验材料。农业院校畜牧兽医、生物科学和生物技术等专业对于这个实验项目的要求较高，除了常规的胞器（细胞核、食物泡和刺丝泡等）观察外，伸缩泡也是必须观察的胞器。针对该实验，许多教学和科研人员对尾草履虫细胞器的观察方法进行了改进和优化[2-3]，对细胞核、食物泡和刺丝泡等胞器均取得了较好的观察效果[5-6]。较之上述器官，伸缩泡结构复杂，动态活动性强，想在课堂较短时间内得到良好的效果略有难度。因此，探寻适用于课堂教学，利于学生操作的方法进行伸缩泡的观察，是实验指导教师和理论课授课教师一直关注的问题。本文将报道一种较为有效的观察草履虫伸缩泡动态变化过程的简易方法，供动物学实验教学人员参考。
1 材料
1.1 动物材料 尾草履虫（Paramecium caudatum）：采集于沈阳市马官桥下，培养于沈阳农业大学生物科学实验室，繁殖至150代左右且密度较大时用于本实验。
1.2 试剂 石碳酸品红溶液、美兰染液、醋酸、戊巴比妥钠、乙醇、生菜汁培养液、甲基纤维素等。
1.3 仪器和用具 恒温培养箱、体式显微镜、显微镜及摄像系统、恒温震荡器、冰箱、电子天平、微量移液器、低速离心机等。培养皿、试管、胶头滴管、微吸管、载玻片、盖玻片等。
1.4 消耗性材料 枪头、离心管、滤纸、脱脂棉等。
2 方法
2.1 尾草履虫伸缩泡观察时麻醉剂的添加及观察
将梯度浓度的5种常用化学试剂分别配制为0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%等7个梯度浓度，分别加入预先放入100只尾草履虫的厚凹片中滴加5mL，室温放置20min后，进行存活率的检测，每种试剂筛选出1个适宜的剂量，该适宜剂量应为虫体被较好的麻醉且存活率较高。在该适宜剂量的处理中吸取状态良好的个体置于显微镜下进行观察，确定伸缩泡和收集管的观察效果。
2.2 伸缩泡简易观察法 吸取尾草履虫培养液（虫体密度大时效果较好）1滴于清洁的载玻片上，待液滴稍散开时，在液滴中部滴加少许用培养液配制成的2%美兰染液。如较难控制滴加量时可用解剖针等蘸取少许染色液溶于培养液滴中部，待染色液滴稍散开但未扩散均匀时，制成草履虫临时装片。
2.3 伸缩泡观察装片盖片支撑物的选择 选择5种常用支撑物进行常规压片，对其封片和观察效果进行检测，筛选出适用于观察伸缩泡装片制作的适宜支撑物。 3 结果与分析
3.1 5种化学试剂对尾草履虫存活率的影响 根据方法2.1测定5种化学试剂（5个梯度）对尾草履虫存活率的影响，其结果如表1所示。由表1可知，5种化学试剂均得到了存活率较高的浓度，分别为1.5%石碳酸品红、2.0%的美兰染色液、0.5%的醋酸溶液、0.25%的戊巴比妥钠和0.5%的乙醇。
3.2 5种化学试剂适宜剂量处理尾草履虫后观察伸缩泡的效果 按照方法2.1筛选出适宜剂量，对适宜剂量处理的细胞进行观察，其结果如表2所示。由表2可知，2.0%的美兰染液、0.5%的醋酸溶液和0.5%的乙醇溶液处理后，可在镜下观察到伸缩泡，其中美兰染液组的伸缩泡较为清晰，收集管可见度高，收集管活动频率较易计数，本实验计数为17次/min。这种状态的维持时间为19min，对于课堂教学的观察时间较为充裕。
3.3 观察结果 根据方法2.2，应用2.0%的美兰溶液对草履虫进行处理后，置于显微镜下进行观察，观察结果表明：在镜下寻找处于不动状态但并未死亡的虫体，在细胞前后部找到伸缩泡（图1的1～3），此时将物镜转为高倍进行仔细观察，可清晰的看到伸缩泡和收集管的交替活动（图1的4～6）。滴加染色液后待液滴未均匀时进行压片可在小范围内形成1个剂量梯度，剂量大的位置虫体被较深麻醉甚至杀死，剂量较小的位置虫体麻醉程度小或仍可处于自由活动状态，这2种状态均不利于伸缩泡的观察，但这2种状态的中间位置可找到虫体处于适度麻醉而胞器活动正常的个体。装片制成片刻后，美兰染色液即可适量渗入伸缩泡，在显微镜下呈现极浅的蓝色，将视野略加调暗，观察效果十分理想。此种方法观察伸缩泡正常活动时程较长，可达20min以上，适于实验课堂操作。时间过久后染色液逐渐扩散均匀导致伸缩泡过度膨胀，最终解体。
3.4 4种临时装片支撑物的使用结果 根据方法2.3选取5种盖玻片支撑物，制作临时装片后，对支撑物的效果进行检测，其结果如表1所示。由表3可知：支撑力较强的尾棉花和10%甲基纤维素；甲基纤维素的溶解速度较胶水和浆糊慢；盖片距离的精确控制力方面仅有10%的甲基纤维素效果最好。
4 讨论
原生动物为实验教学和科学研究中常用的实验动物，尾草履虫作为常规实验教学的材料具有较多优势：易于采集和培养，细胞核小核个体大，染色和观察操作简单等。伸缩泡是原生动物的重要胞器，行使水分调节和代谢废物的排出等功能，为使理论课堂的知识得以巩固，实验教学中应进行更详细的观察和讲解，但伸缩泡的观察效果一直不尽人意，尤其是实验课堂时间短，学生操作不熟练等。伸缩泡未能得到较好观察的主要原因如下：（1）该细胞器为膜泡状组成，在活体中不易观察；（2）活动的规律性较强，如用一般染料进行固定后观察不到其动态过程；（3）位置深埋于细胞质中。为使学生更好地掌握这个器官的特点，本实验专门针对该问题进行了探讨，寻找出一种较为适用于课堂的观察方法，将细胞处理后处于既未死亡又不运动的麻醉状态进行观察，应用美兰染色液处理效果比較理想。该方法得以成功使用的前提是具备一定的临时装片制备技术，尤其是盖玻片支撑物的选择，10%的甲基纤维较为适用。
参考文献
[1]李力，谢娟英.培养液对尾草履虫种群增长和个体形态的影响[J].西北大学学报，2004，3：314-316.
[2]杨仙玉.教学中草履虫活体观察方法[J].中国科教创新导刊，2010，2：88-89.
[3]唐发辉，赵元莙，汪婷.食物泡在草履虫体内移行现象与伸缩泡频率的相关研究分析[J].教育教学论坛，2015，8：67-68.
[4]J.Venkateswara Rao，S.K.Arepalli，V.G.Gunda，et al.Assessment of cytoskeletal damage in Paramecium caudatum：An early warning system for apoptotic studies[J].Protist，2018，6：205-219.
[5]高晶.尾草履虫、尾柱虫和魏氏拟尾柱虫形态、细胞内部及表膜下结构的观察[D].哈尔滨：哈尔滨师范大学，2012.
[6]杨仙玉.观察草履虫细胞核的两种染色方法[J].科技创新导报，2010，3：240.
（责编：张宏民）