论文部分内容阅读
【摘 要】目的：观察海洋胶原肽（marine collagen peptides， MCPs）对大鼠术后伤口愈合的影响，以期为术后营养支持提供实验室依据。方法：取120只体重为230-250g的SD大鼠，分为5组，每组24只，包括空白对照组和4个MCPs组（分别为0.667g/kg.bw、2.0g/kg.bw、6.0g/kg.bw和12g/kg.bw），空白对照组给予等体积溶剂灌胃，进行背部皮肤深达腹腔的切口手术，分别于术后第3、7、14天处死动物，各时间点8只动物。术后每日观察伤口的愈合情况，进行HE染色、Masson染色，皮肤切口抗张力强度测定和羟脯氨酸测定。结果：MCPs能够促进伤口恢复，增强皮肤切口的胶原纤维表达和抗张力强度。结论： MCPs可以通过改善大鼠术后的营养状况进而促进伤口愈合。
【关键词】海洋胶原肽；营养支持；手术；伤口愈合
【中图分类号】R719.8 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0071—03
实践证明，通过对住院病人进行合理正确的营养支持，加强或调整住院病人的营养状况，将会对病人的常规药物、手术治疗效果产生积极影响，提高有效治愈率，降低死亡率，延长病人生命同时可以减少住院时间、降低医疗费用。 然而据统计，约有20%～40%的住院病人有营养不良，尤其是那些消耗性或慢性病的患者，营养不良的发生率更高[1、2]。营养不良，特别是蛋白质-能量营养不良对于手术后病人的预后会产生严重的不良影响，主要表现为伤口愈合不良，其发生概率达7%[3]，所以通过合理的术后营养支持来促进伤口愈合一直是在临床治疗中广为重视的一个问题。本研究拟建立术后营养支持的动物试验模型，观察海洋胶原肽（marine collagen peptides， MCPs）对大鼠术后伤口愈合的影响，以期为促进外科手术后伤口愈合的营养支持提供理论依据和实验依据。
1 材料与方法
1.1 受试物
海洋胶原肽由北京中食海氏生物技术有限公司提供，淡黄色粉末状，以深海鱼的鱼皮为主要原料，经过清洗匀浆-复合偶联酶解-酶失活-脱脂-多级膜分离-渗透精制-浓缩-脱色-造粒干燥等工艺制成。
1.2 实验动物
健康雄性SPF级SD大鼠，体重230～250克，由北京大學医学部实验动物中心提供，合格证号为SCXK（京）-2006-2008。清洁级动物房饲养，饲养环境温度21～23℃，湿度50%～60%RH。
1.3 主要仪器和试剂
UV7512GD型紫外可见分光光度计（上海欣益仪器仪表有限公司），离心机（Eppendorf 5840R），XH2B型漩涡混匀器，电子天平，多功能生物信号采集系统。羟脯氨酸试剂盒购自南京建成生物制品工程研究所，其他试剂均为国产或进口分析纯。
1.4 实验方法
1.4.1 动物模型建立方法
大鼠经1%戊巴比妥钠麻醉后，剃去背部皮肤，常规皮肤消毒，背部两侧分别切一个2cm长的纵行切口，同时切开肌肉，深达腹腔，然后逐层缝合肌肉和皮肤。整个过程模拟临床外科手术过程，同时手术当天计为术后第0天（post operation day 0. POD0），以此类推。
1.4.2 实验动物分组
取120只体重为230-250g的大鼠，随即分为5组，每组24只，包括空白对照组和4个海洋胶原肽组（分别为0.667g/kg.bw、2.0g/kg.bw 、6.0g/kg.bw和12g/kg.bw，相当于人体推荐剂量的3.3倍、10倍、30倍和60倍），空白对照组给予等体积溶剂灌胃。手术当天开始，每日灌胃。分别于第3、7、14天处死大鼠，每个时间点各8只动物。
1.4.3 伤口愈合观察
1.4.3.1 肉眼观察
每日用放大镜观察切口变化情况。各组于术后第3天观察伤口及其周围组织的创伤反应，第7、14天观察伤口的恢复情况。术后创伤反应及伤口恢复情况统一按本实验室自制标准评定。
1.4.3.1.1 伤口及其周围组织的创伤反应评定：①Ⅰ期反应。伤口有轻度肿胀。②Ⅱ期反应。伤口及周围组织轻度水肿，皮下有散在淤血斑。③Ⅲ期反应。切口有少量血痂附着，伤口及周围组织明显水肿。
1.4.3.1.2 伤口恢复情况评定：①优。伤口组织无肿胀，皮肤青紫现象消失。②良。伤口组织轻度肿胀，皮下淤血斑消失，青紫现象逐渐消退。③差。伤口及周围组织肿胀。
1.4.3.2 切口愈合的组织病理学观察
各组大鼠分别于术后第3、7、14天于伤口处距切口边缘约0.5cm取全层皮肤组织。左侧伤口所取组织的一半用4%多聚甲醛固定，保存待做石蜡切片及HE、Masson染色，另一半用于抗拉力检测，右侧伤口皮肤用于羟脯氨酸测定和其他指标的检测。
1.4.3.3胶原纤维染色（Masson染色）
组织切片脱蜡至蒸馏水，苏木素染色5～10分钟，盐酸酒精分化，流水蓝化，蒸馏水洗，丽春红酸性品红液中染5～8分钟，蒸馏水，1% 磷钼酸中染1～3分钟，直接入苯胺蓝液或亮绿液5分钟，水速洗，置60℃温箱中烘干，二甲苯透明，封固。结果：胶原纤维绿色，肌纤维、纤维素红色。
1.4.3.4 切口的抗张强度检测
术后第7、14天，沿切口垂直方向切取以切口为中线，宽为0. 5cm长为中线双侧各0. 5cm，并包含切口在内的皮肤组织，去除皮下脂肪组织，于长方形短边以丝线缝合作为牵引线，将皮条置于带有张力感受器的装置中间，张力感受器另一端连接于多功能生物信号采集系统，采用带有游标卡尺的微调装置手动逐渐拉伸皮条，记录皮条被拉断时的张力。测微尺测量皮肤的厚度，每平方毫米面积的张力即为切口的抗张强度。 1.4.3.5 羟脯氨酸测定
切取大鼠切口周围2-3毫米的皮肤用于测定羟脯氨酸，方法依据南京建成生物工程公司的羟脯氨酸检测试剂盒进行操作。
1.4.4 统计方法
采用SPSS软件进行单因素方差分析，实验数据以均数±标准差（`X±S）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1大鼠术后伤口愈合的肉眼观察结果
肉眼观察表现，术后第3天，对照组大鼠伤口多数有血痂附着，伤口及周围组织明显水肿，而海洋胶原肽组大鼠伤口的水肿程度明显减轻（表1）（图1）。术后第7（图2）和14天（图3），海洋胶原肽组大鼠伤口愈合明显好于对照组大鼠伤口。海洋胶原肽组大鼠比对照组大鼠伤口提前1-2天愈合，同时发现6.0g/kg.bw和12g/kg.bw剂量组愈合最佳（表2）
3 讨论
手术伤口愈合不良的原因非常复杂，主要有：脂肪液化、无菌性毒性反应、年龄老化、营养不良、用药不当、局部感染或血液循环不良等，营养不良和局部感染是手术伤口愈合不良非常重要的原因[4]。本研究首次从营养支持的角度探讨海洋胶原肽作为一种肠内营养制剂的补充剂对于手术后伤口愈合的影响。
手术所致的创伤及并发症或伴发的感染等使机体处于高代谢状态，造成机体相对的营养不足。本实验室前期结果发现海洋胶原肽是以鲑鱼等深海鱼皮为主要原料，采用生物酶解技术生产得到的混合寡肽，由2～6个氨基酸组成，相对分子质量在100～860，具有吸收快、低黏度、水溶性好等特點，而且在体内吸收快、利用率高；其作为食物也是人体蛋白质合成的重要来源[5]。手术创伤后肠结构和功能，与代谢状态密切相关，早期的肠内营养，肠腔内营养物质即具有局部的营养作用，可以刺激肠道粘膜上皮细胞的生长，促进胃肠激素的分泌，从而保持肠道粘膜结构和功能的完整性[6]。肠内营养可防止肠黏膜萎缩，保护肠屏障；减少肠源性内毒素移位，继而减少了因内毒素诱发的炎性因子和细胞因子的连锁反应，使组织器官损伤减轻，机体免疫能力得以保护。本实验室还研究发现海洋胶原肽具有较强的抗氧化活性，可以清除体内的自由基，减少炎症反应，增强小鼠免疫功能，进而增强抗感染能力[7]。本实验发现海洋胶原肽能够促进术后大鼠伤口愈合，可能与海洋胶原肽能够改善术后营养不良和抗感染密切相关。
创伤愈合的一个重要过程，是酸性成纤维细胞利用氨基酸原料，合成胶原蛋白，如果其物质基础氨基酸原料供给不足，必将造成愈合延迟[8、9]。本次实验和本课题组前期实验[10]都发现可通过促进伤口皮肤胶原蛋白的合成，从而促进伤口愈合。从组织病理学结果发现海洋胶原肽能够趋化诱导炎症细胞到伤口处，刺激成纤维细胞增殖和分化，促使细胞合成分泌细胞外基质如胶原等。这也可能是海洋胶原肽促进伤口愈合的机制之一。
通过近几年来对伤口愈合相关文献的紧密追踪，发现以前对伤口愈合的研究模型主要是采用动物皮肤伤口打孔手术模型和单纯的皮肤切口手术模型，这仅仅针对皮肤进行损伤，只能反应皮肤的愈合过程。而在临床实践中伤口愈合是一个全身整体的过程，单纯的皮肤损伤无法体现临床手术的全过程。本项目的一大特色是建立深达腹腔的手术模型，该模型可以模拟临床外科手术的整个过程，国内尚属首次报道，以更加全面的反应手术后患者身体变化的动态过程。
参考文献：
[1] 黎介寿.营养支持在外科病人治疗中的作用[J].中国实用外科杂志，1998，18（12）： 709-710.
[2] Clark RG. Effect of nutrition support on clinical outcome[J]. Clinical Nutrition. 2003，22 suppl 2：S69-71
[3] Bozzetti F， Braga M， Gianotti L. Postoperative enteral versus parenteral nutrition in malnourished patients with gastrointestinal cancer： a randomized multicentre trial[J]. Lancet. 2001， 358（9292）：1487-1492.
[4] Waitzberg DL，Caiaffa WT，Correia MI. Hospital malnutrition：the Brazilian national survey （IBRANUTRI）：a study of 4000 patients[J].Nutrition，2001，17：573-580.
[5] 王军波，谢英，裴新荣，等.海洋胶原肽的分子组成及其降血脂和抗氧化作用研究[J].中华预防医学杂志.2008，42（4）：226-230.
[6] Atalay BG， Yagmur C， Nursal TZ， et al. Use of subjective global assessment and clinical outcomes in crirically ill geriatric patients receiving nutrition support[J]. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition.2008，32（4）：454-459.
[7] Yang R， Zhang Z， Pei X， et al. Immunomodulatory effects of marine oligopeptide preparation from Chum Salmon （Oncorhynchus keta） in mice[J]. Food Chemistry， 2009，113（2）：464-470.
[8] 李勇.肽营养学.北京：北京大学医学出版社.第一版.2007.
[9] Zague V. A new view concerning the effects of collagen hydrolysate intake on skin properties[J]. Archives of Dermatological Research. 2008， 300（9）：479-483.
[10] 裴新荣， 杨睿悦， 张召锋， 等. 海洋胶原肽抗皮肤老化作用的实验研究[J].中华预防医学杂志.2008，42（4）：235-238.
【关键词】海洋胶原肽；营养支持；手术；伤口愈合
【中图分类号】R719.8 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0071—03
实践证明，通过对住院病人进行合理正确的营养支持，加强或调整住院病人的营养状况，将会对病人的常规药物、手术治疗效果产生积极影响，提高有效治愈率，降低死亡率，延长病人生命同时可以减少住院时间、降低医疗费用。 然而据统计，约有20%～40%的住院病人有营养不良，尤其是那些消耗性或慢性病的患者，营养不良的发生率更高[1、2]。营养不良，特别是蛋白质-能量营养不良对于手术后病人的预后会产生严重的不良影响，主要表现为伤口愈合不良，其发生概率达7%[3]，所以通过合理的术后营养支持来促进伤口愈合一直是在临床治疗中广为重视的一个问题。本研究拟建立术后营养支持的动物试验模型，观察海洋胶原肽（marine collagen peptides， MCPs）对大鼠术后伤口愈合的影响，以期为促进外科手术后伤口愈合的营养支持提供理论依据和实验依据。
1 材料与方法
1.1 受试物
海洋胶原肽由北京中食海氏生物技术有限公司提供，淡黄色粉末状，以深海鱼的鱼皮为主要原料，经过清洗匀浆-复合偶联酶解-酶失活-脱脂-多级膜分离-渗透精制-浓缩-脱色-造粒干燥等工艺制成。
1.2 实验动物
健康雄性SPF级SD大鼠，体重230～250克，由北京大學医学部实验动物中心提供，合格证号为SCXK（京）-2006-2008。清洁级动物房饲养，饲养环境温度21～23℃，湿度50%～60%RH。
1.3 主要仪器和试剂
UV7512GD型紫外可见分光光度计（上海欣益仪器仪表有限公司），离心机（Eppendorf 5840R），XH2B型漩涡混匀器，电子天平，多功能生物信号采集系统。羟脯氨酸试剂盒购自南京建成生物制品工程研究所，其他试剂均为国产或进口分析纯。
1.4 实验方法
1.4.1 动物模型建立方法
大鼠经1%戊巴比妥钠麻醉后，剃去背部皮肤，常规皮肤消毒，背部两侧分别切一个2cm长的纵行切口，同时切开肌肉，深达腹腔，然后逐层缝合肌肉和皮肤。整个过程模拟临床外科手术过程，同时手术当天计为术后第0天（post operation day 0. POD0），以此类推。
1.4.2 实验动物分组
取120只体重为230-250g的大鼠，随即分为5组，每组24只，包括空白对照组和4个海洋胶原肽组（分别为0.667g/kg.bw、2.0g/kg.bw 、6.0g/kg.bw和12g/kg.bw，相当于人体推荐剂量的3.3倍、10倍、30倍和60倍），空白对照组给予等体积溶剂灌胃。手术当天开始，每日灌胃。分别于第3、7、14天处死大鼠，每个时间点各8只动物。
1.4.3 伤口愈合观察
1.4.3.1 肉眼观察
每日用放大镜观察切口变化情况。各组于术后第3天观察伤口及其周围组织的创伤反应，第7、14天观察伤口的恢复情况。术后创伤反应及伤口恢复情况统一按本实验室自制标准评定。
1.4.3.1.1 伤口及其周围组织的创伤反应评定：①Ⅰ期反应。伤口有轻度肿胀。②Ⅱ期反应。伤口及周围组织轻度水肿，皮下有散在淤血斑。③Ⅲ期反应。切口有少量血痂附着，伤口及周围组织明显水肿。
1.4.3.1.2 伤口恢复情况评定：①优。伤口组织无肿胀，皮肤青紫现象消失。②良。伤口组织轻度肿胀，皮下淤血斑消失，青紫现象逐渐消退。③差。伤口及周围组织肿胀。
1.4.3.2 切口愈合的组织病理学观察
各组大鼠分别于术后第3、7、14天于伤口处距切口边缘约0.5cm取全层皮肤组织。左侧伤口所取组织的一半用4%多聚甲醛固定，保存待做石蜡切片及HE、Masson染色，另一半用于抗拉力检测，右侧伤口皮肤用于羟脯氨酸测定和其他指标的检测。
1.4.3.3胶原纤维染色（Masson染色）
组织切片脱蜡至蒸馏水，苏木素染色5～10分钟，盐酸酒精分化，流水蓝化，蒸馏水洗，丽春红酸性品红液中染5～8分钟，蒸馏水，1% 磷钼酸中染1～3分钟，直接入苯胺蓝液或亮绿液5分钟，水速洗，置60℃温箱中烘干，二甲苯透明，封固。结果：胶原纤维绿色，肌纤维、纤维素红色。
1.4.3.4 切口的抗张强度检测
术后第7、14天，沿切口垂直方向切取以切口为中线，宽为0. 5cm长为中线双侧各0. 5cm，并包含切口在内的皮肤组织，去除皮下脂肪组织，于长方形短边以丝线缝合作为牵引线，将皮条置于带有张力感受器的装置中间，张力感受器另一端连接于多功能生物信号采集系统，采用带有游标卡尺的微调装置手动逐渐拉伸皮条，记录皮条被拉断时的张力。测微尺测量皮肤的厚度，每平方毫米面积的张力即为切口的抗张强度。 1.4.3.5 羟脯氨酸测定
切取大鼠切口周围2-3毫米的皮肤用于测定羟脯氨酸，方法依据南京建成生物工程公司的羟脯氨酸检测试剂盒进行操作。
1.4.4 统计方法
采用SPSS软件进行单因素方差分析，实验数据以均数±标准差（`X±S）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1大鼠术后伤口愈合的肉眼观察结果
肉眼观察表现，术后第3天，对照组大鼠伤口多数有血痂附着，伤口及周围组织明显水肿，而海洋胶原肽组大鼠伤口的水肿程度明显减轻（表1）（图1）。术后第7（图2）和14天（图3），海洋胶原肽组大鼠伤口愈合明显好于对照组大鼠伤口。海洋胶原肽组大鼠比对照组大鼠伤口提前1-2天愈合，同时发现6.0g/kg.bw和12g/kg.bw剂量组愈合最佳（表2）
3 讨论
手术伤口愈合不良的原因非常复杂，主要有：脂肪液化、无菌性毒性反应、年龄老化、营养不良、用药不当、局部感染或血液循环不良等，营养不良和局部感染是手术伤口愈合不良非常重要的原因[4]。本研究首次从营养支持的角度探讨海洋胶原肽作为一种肠内营养制剂的补充剂对于手术后伤口愈合的影响。
手术所致的创伤及并发症或伴发的感染等使机体处于高代谢状态，造成机体相对的营养不足。本实验室前期结果发现海洋胶原肽是以鲑鱼等深海鱼皮为主要原料，采用生物酶解技术生产得到的混合寡肽，由2～6个氨基酸组成，相对分子质量在100～860，具有吸收快、低黏度、水溶性好等特點，而且在体内吸收快、利用率高；其作为食物也是人体蛋白质合成的重要来源[5]。手术创伤后肠结构和功能，与代谢状态密切相关，早期的肠内营养，肠腔内营养物质即具有局部的营养作用，可以刺激肠道粘膜上皮细胞的生长，促进胃肠激素的分泌，从而保持肠道粘膜结构和功能的完整性[6]。肠内营养可防止肠黏膜萎缩，保护肠屏障；减少肠源性内毒素移位，继而减少了因内毒素诱发的炎性因子和细胞因子的连锁反应，使组织器官损伤减轻，机体免疫能力得以保护。本实验室还研究发现海洋胶原肽具有较强的抗氧化活性，可以清除体内的自由基，减少炎症反应，增强小鼠免疫功能，进而增强抗感染能力[7]。本实验发现海洋胶原肽能够促进术后大鼠伤口愈合，可能与海洋胶原肽能够改善术后营养不良和抗感染密切相关。
创伤愈合的一个重要过程，是酸性成纤维细胞利用氨基酸原料，合成胶原蛋白，如果其物质基础氨基酸原料供给不足，必将造成愈合延迟[8、9]。本次实验和本课题组前期实验[10]都发现可通过促进伤口皮肤胶原蛋白的合成，从而促进伤口愈合。从组织病理学结果发现海洋胶原肽能够趋化诱导炎症细胞到伤口处，刺激成纤维细胞增殖和分化，促使细胞合成分泌细胞外基质如胶原等。这也可能是海洋胶原肽促进伤口愈合的机制之一。
通过近几年来对伤口愈合相关文献的紧密追踪，发现以前对伤口愈合的研究模型主要是采用动物皮肤伤口打孔手术模型和单纯的皮肤切口手术模型，这仅仅针对皮肤进行损伤，只能反应皮肤的愈合过程。而在临床实践中伤口愈合是一个全身整体的过程，单纯的皮肤损伤无法体现临床手术的全过程。本项目的一大特色是建立深达腹腔的手术模型，该模型可以模拟临床外科手术的整个过程，国内尚属首次报道，以更加全面的反应手术后患者身体变化的动态过程。
参考文献：
[1] 黎介寿.营养支持在外科病人治疗中的作用[J].中国实用外科杂志，1998，18（12）： 709-710.
[2] Clark RG. Effect of nutrition support on clinical outcome[J]. Clinical Nutrition. 2003，22 suppl 2：S69-71
[3] Bozzetti F， Braga M， Gianotti L. Postoperative enteral versus parenteral nutrition in malnourished patients with gastrointestinal cancer： a randomized multicentre trial[J]. Lancet. 2001， 358（9292）：1487-1492.
[4] Waitzberg DL，Caiaffa WT，Correia MI. Hospital malnutrition：the Brazilian national survey （IBRANUTRI）：a study of 4000 patients[J].Nutrition，2001，17：573-580.
[5] 王军波，谢英，裴新荣，等.海洋胶原肽的分子组成及其降血脂和抗氧化作用研究[J].中华预防医学杂志.2008，42（4）：226-230.
[6] Atalay BG， Yagmur C， Nursal TZ， et al. Use of subjective global assessment and clinical outcomes in crirically ill geriatric patients receiving nutrition support[J]. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition.2008，32（4）：454-459.
[7] Yang R， Zhang Z， Pei X， et al. Immunomodulatory effects of marine oligopeptide preparation from Chum Salmon （Oncorhynchus keta） in mice[J]. Food Chemistry， 2009，113（2）：464-470.
[8] 李勇.肽营养学.北京：北京大学医学出版社.第一版.2007.
[9] Zague V. A new view concerning the effects of collagen hydrolysate intake on skin properties[J]. Archives of Dermatological Research. 2008， 300（9）：479-483.
[10] 裴新荣， 杨睿悦， 张召锋， 等. 海洋胶原肽抗皮肤老化作用的实验研究[J].中华预防医学杂志.2008，42（4）：235-238.