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摘要：硫化氢（H2S）作为重要的信号分子，调控着植物的生长发育。应用双向电泳技术（2-DE）分析了水稻幼苗叶片经不同浓度的H2S处理后蛋白质表达谱的变化，并获得29个表达丰度差异2倍以上的蛋白质。鉴定的差异蛋白质主要涉及到光合作用 （43%），能量代谢 （9%），氧化还原平衡 （13%），蛋白质合成、折叠、加工与降解 （19%），信号转导 （3%）等。gene ontology（GO）分析发现，受硫化氢调控的差异，蛋白主要参与光合作用、防御和非生物胁迫应答等过程。表明不同浓度的硫化氢在调控水稻幼苗的形态变化方面主要涉及到光合过程和胁迫应答。
关键词：水稻，H2S，蛋白质组，双向电泳
中图分类号： S511.01 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）11-0081-04
硫化氢（H2S）是近10年来继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）后在生物体内新发现的第3种内源性气体信号分子[1]，在植物体内主要是通过半胱氨酸脱巯基酶（CDes）催化半胱氨酸（Cys）降解生成。相关研究表明，H2S广泛参与调节植物各种生理过程，如植物细胞的信号转导、促进种子萌发、调节光合作用和根系发育、参与气孔运动、缓解逆境胁迫等[2-7]。H2S供体能显著提高小麦种子内β-淀粉酶、酯酶的活性，提供可溶性糖、可溶性蛋白和游离氨基酸，为小麦种子的萌发提供良好的环境从而促进其发芽[8]，Wang等研究表明，0.01～0.13 mmol/L NaHS均能不同程度地缓解NaCl对小麦种子萌发率的抑制作用[7]。在干旱胁迫下，王兰香等发现H2O2能够诱导拟南芥L/D-CD基因的表达以提高叶片H2S含量来关闭气孔，防止水分蒸发[9]。方慧慧等研究证明，在植物体内H2S和Ca2 信号存在复杂的关系，H2S能激活Ca2 信号下游相关基因的表达，同时Ca2 能增强H2S的产生，并且它们可以通过调节重金属离子转运蛋白增强谷子对Cr6 的耐受性[10]。在缓解铜胁迫造成的伤害中，Shan等研究表明，外源H2S能调节植物非酶类抗氧化剂维生素C和还原型谷胱甘肽（GSH）循环，增加叶片维生素C、GSH 含量，提高GSH、维生素C清除活性氧速率[11]。
相关研究中我们发现，不同浓度的H2S对水稻幼苗形态和生理生化有不同的效应，低浓度H2S能显著促进幼苗生长，而高浓度的H2S对水稻幼苗生长有明显的抑制作用[12]。为了了解硫化氢影响水稻幼苗生长发育的分子基础，本研究通过蛋白质组技术分析了施加不同浓度硫化氢的水稻幼苗叶片蛋白质表达谱的变化及其参与的生物学过程。
1 材料与方法
1.1 材料及处理
试验材料为圣稻16（Oryza sativa Shengdao 16）。挑选颗粒饱满种子，用0.1% HgCl2消毒10 min，去离子水冲洗数次，25 ℃恒温箱黑暗中浸种催芽48 h。萌发后选取露白一致的种子用镊子整齐摆放在垫有滤纸的培养皿（直径12 cm）中，加入适量清水，水量以不浸没种子为标准，保持皿中水量充足。当苗长至1叶1心时，选择长势一致的幼苗用海绵松松地包裹，嵌入有孔泡沫板（厚度1.5 cm）中，放在盛有1/2 Hoagland营养液（2 L）塑料箱内，置于HP1000GS型智能人工气候箱中水培。昼、夜温度分别为28、25 ℃，相对湿度为60%～70%，白天给予光照12 h[1 000 μmol/（m2·s）]。培养箱适应生长1 d后，用含有NaHS（H2S的供体）的Hoagland营养液，浓度分别为：0（CK）、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mmol/L培养，每2 d换1次，共处理3次。每个处理135株苗（3箱），3个重复，每个重复45株苗（1箱）。于开始处理后7 d，液氮取样保存，进行各项蛋白质组学指标的测定。
1.2 蛋白质样品的制备
采用TCA/丙酮沉淀方法[13]提取水稻叶片总蛋白。首先称取1 g左右鲜质量材料于预冷研钵中，液氮研磨并加入10%样品质量的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），将研磨好的粉末转移至离心管中，1个样加20 mL-20 ℃预冷的10%TCA-丙酮，之后涡旋至少1.5 h，-20 ℃静置沉淀，后12 000 r/min离心30 min去上清液。然后加20 mL丙酮和0.02 g 0.1% DTT 到离心管中，将沉淀捣碎，重复3次，-20 ℃存放。之后再离心，盖上滤纸，真空干燥后进行第1次裂解，约2 h，用玻璃棒不定时搅动。样品溶解在蛋白质裂解液中，理论上加入 20 μL/mg 裂解液，其配方为每10 mL裂解液中含4.204 2 g 7 moL/L 尿素，1.522 4 g 2 moL/L硫脲，0.4 g 4% CHAPS，60 μL 0.3
关键词：水稻，H2S，蛋白质组，双向电泳
中图分类号： S511.01 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）11-0081-04
硫化氢（H2S）是近10年来继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）后在生物体内新发现的第3种内源性气体信号分子[1]，在植物体内主要是通过半胱氨酸脱巯基酶（CDes）催化半胱氨酸（Cys）降解生成。相关研究表明，H2S广泛参与调节植物各种生理过程，如植物细胞的信号转导、促进种子萌发、调节光合作用和根系发育、参与气孔运动、缓解逆境胁迫等[2-7]。H2S供体能显著提高小麦种子内β-淀粉酶、酯酶的活性，提供可溶性糖、可溶性蛋白和游离氨基酸，为小麦种子的萌发提供良好的环境从而促进其发芽[8]，Wang等研究表明，0.01～0.13 mmol/L NaHS均能不同程度地缓解NaCl对小麦种子萌发率的抑制作用[7]。在干旱胁迫下，王兰香等发现H2O2能够诱导拟南芥L/D-CD基因的表达以提高叶片H2S含量来关闭气孔，防止水分蒸发[9]。方慧慧等研究证明，在植物体内H2S和Ca2 信号存在复杂的关系，H2S能激活Ca2 信号下游相关基因的表达，同时Ca2 能增强H2S的产生，并且它们可以通过调节重金属离子转运蛋白增强谷子对Cr6 的耐受性[10]。在缓解铜胁迫造成的伤害中，Shan等研究表明，外源H2S能调节植物非酶类抗氧化剂维生素C和还原型谷胱甘肽（GSH）循环，增加叶片维生素C、GSH 含量，提高GSH、维生素C清除活性氧速率[11]。
相关研究中我们发现，不同浓度的H2S对水稻幼苗形态和生理生化有不同的效应，低浓度H2S能显著促进幼苗生长，而高浓度的H2S对水稻幼苗生长有明显的抑制作用[12]。为了了解硫化氢影响水稻幼苗生长发育的分子基础，本研究通过蛋白质组技术分析了施加不同浓度硫化氢的水稻幼苗叶片蛋白质表达谱的变化及其参与的生物学过程。
1 材料与方法
1.1 材料及处理
试验材料为圣稻16（Oryza sativa Shengdao 16）。挑选颗粒饱满种子，用0.1% HgCl2消毒10 min，去离子水冲洗数次，25 ℃恒温箱黑暗中浸种催芽48 h。萌发后选取露白一致的种子用镊子整齐摆放在垫有滤纸的培养皿（直径12 cm）中，加入适量清水，水量以不浸没种子为标准，保持皿中水量充足。当苗长至1叶1心时，选择长势一致的幼苗用海绵松松地包裹，嵌入有孔泡沫板（厚度1.5 cm）中，放在盛有1/2 Hoagland营养液（2 L）塑料箱内，置于HP1000GS型智能人工气候箱中水培。昼、夜温度分别为28、25 ℃，相对湿度为60%～70%，白天给予光照12 h[1 000 μmol/（m2·s）]。培养箱适应生长1 d后，用含有NaHS（H2S的供体）的Hoagland营养液，浓度分别为：0（CK）、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mmol/L培养，每2 d换1次，共处理3次。每个处理135株苗（3箱），3个重复，每个重复45株苗（1箱）。于开始处理后7 d，液氮取样保存，进行各项蛋白质组学指标的测定。
1.2 蛋白质样品的制备
采用TCA/丙酮沉淀方法[13]提取水稻叶片总蛋白。首先称取1 g左右鲜质量材料于预冷研钵中，液氮研磨并加入10%样品质量的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），将研磨好的粉末转移至离心管中，1个样加20 mL-20 ℃预冷的10%TCA-丙酮，之后涡旋至少1.5 h，-20 ℃静置沉淀，后12 000 r/min离心30 min去上清液。然后加20 mL丙酮和0.02 g 0.1% DTT 到离心管中，将沉淀捣碎，重复3次，-20 ℃存放。之后再离心，盖上滤纸，真空干燥后进行第1次裂解，约2 h，用玻璃棒不定时搅动。样品溶解在蛋白质裂解液中，理论上加入 20 μL/mg 裂解液，其配方为每10 mL裂解液中含4.204 2 g 7 moL/L 尿素，1.522 4 g 2 moL/L硫脲，0.4 g 4% CHAPS，60 μL 0.3