【摘 要】
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目的 对人促红细胞生成素(human erythropoietin,HuEPO)基因进行优化,提高其在大肠杆菌中的表达量以及纯化过程中的回收率.方法 对HuEPO基因的碱基序列进行设计,用大肠杆菌偏
【机 构】
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610041,成都蓉生药业有限责任公司科研管理部
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目的 对人促红细胞生成素(human erythropoietin,HuEPO)基因进行优化,提高其在大肠杆菌中的表达量以及纯化过程中的回收率.方法 对HuEPO基因的碱基序列进行设计,用大肠杆菌偏爱密码子替换稀有密码子,构建高效表达重组(r) HuEPO(rHuEPO)的基因.设计rHuEPO的氨基酸突变位点,并对这些位点进行定点诱变,获得高亲水性的突变(M) rHuEPO(MrHuEPO).对rHuEPO和MrHuEPO的三级结构进行预测及对比,验证突变位点设计的合理性.将rHuEPO和MrHuEPO基因克隆至表达载体pET-15b,并在大肠杆菌中进行表达.对表达产物进行初步纯化和复性,比较复性时的rHuEPO和MrHuEPO可溶性和回收率,并用HuEPO活性检测试剂盒检测rHuEPO和MrHuEPO的活性.结果 rHuEPO和MrHuEPO在大肠杆菌中得到成功表达,表达量均＞25％.三级结构预测对比结果表明,突变位点设计合理.rHuEPO和MrHuEPO的表达量无明显差别,但复性时MrHuEPO的可溶性(回收率＞90％)明显高于rHuEPO(回收率＜25％).rHuEPO和MrHuEPO的比活分别为2.36×105和2.33×105 IU/mg.结论 成功构建了可在大肠杆菌中高效表达rHuEPO和MrHuEPO的基因,并通过定点诱变提高了复性时的MrHuEPO可溶性.
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