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[摘要]目的 了解三氧化二砷对胃腺癌SGC7901细胞株细胞增殖、细胞凋亡以及bcl-2、cyclin D1基因表达的影响。方法 分别以不同浓度的三氧化二砷作用于SGC7901细胞,作用不同时间后采用MTT检测法对细胞增殖活性进行检测;采用流式细胞仪(FCM)AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率;逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测bcl-2、cyclinD1基因转录水平。结果 稍高浓度(≥2μmol/L)的三氧化二砷可抑制SGC7901细胞增殖,并有剂量和时间依赖性。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测bcl-2、cyclin D1基因转录水平,发现三氧化二砷作用组bcl-2、cyclin D1基因的表达与对照组比较明显减低(P<0.01)。结论 三氧化二砷可有效抑制SGC7901细胞增殖,诱导SGC7901细胞凋亡,与作用剂量和作用时间呈正相关,这一过程可能与三氧化二砷抑制bcl-2、cyclin D1表达有关。
[关键词] 胃腺癌;三氧化二砷;细胞凋亡;bcl-2;cyclin D1
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)04-32-03
Arsenic Trioxide-induced SGC7901 Cell Apoptosis and Its Effect on Gene Expression of bcl-2 and cyclin D1
HUANG DefengZHAO ZhiguoMA JunCUI Yi
Department of Gastroenterology,the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450014,China
[Abstract] Objective To investigate the effect of arsenic trioxide on gastric adenocarcinoma cell line SGC7901 cell proliferation,apoptosis,and bcl-2,cyclin D1 gene expression. Methods SGC7901 cells were treated with different concentrations of arsenic trioxide at different time and after that,the proliferation of SGC7901 cells,the apoptosis rate and the gene transcription level of bcl-2 and cyclin D1 were detected by MTT,by flow cytometry and AnnexinV/PI double staining and by RT-PCR,respectively. Results Slightly high concentration of arsenic trioxide(≥2μmol/L) could inhibit cell proliferation and induce SGC-7901 apoptosis, with a dose-and time -dependency. The bcl-2 and cyclin D1 gene expression was obviously lowered in the arsenic trioxide group than that of the control(P<0.01). Conclusion Arsenic trioxide can effectively inhibit cell proliferation and induce SGC7901 apoptosis,with a direct relation to the dose and time,which may be correlated with the inhibition of bcl-2 and cyclin D1 expression by arsenic trioxide.
[Key words] Gastric adenocarcinoma;Arsenic trioxide;Apoptosis;bcl-2;cyclin D1
三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)是中药砒霜的主要有效成分,近年来研究表明,三氧化二砷除了能治疗血液系统疾病,对包括胃癌在内的多种恶性实体瘤也有强大的杀伤作用。胃癌是我国常见的恶性肿瘤,其对放、化疗的敏感性均较低,死亡率高,晚期尚缺乏有效的治疗手段,寻找新的治疗药物和治疗手段乃当务之急。
诱导胃癌细胞凋亡是治疗的新思路。三氧化二砷可以诱导恶性肿瘤细胞凋亡进而抑制肿瘤生长发挥治疗作用,分子机制涉及多个凋亡调控分子[1]。周期素D1(cyclin D1)能激活CDK2、4、5,促进细胞由G1期进入S期,进行DNA合成,使细胞持续性增殖[2]。bcl-2是从滤泡性淋巴瘤中分离出的一种癌基因,也是细胞凋亡抑制因子,具有抑制细胞凋亡、延长细胞寿命的功能[3]。本研究应用三氧化二砷作用于胃腺癌SGC7901细胞,观察三氧化二砷对SGC7901细胞凋亡的影响,以及此过程中bcl-2、cyclin D1基因表达的变化,探讨三氧化二砷诱导胃腺癌SGC7901细胞凋亡的机制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1仪器 CO2培养箱(美国Thermo)、温度梯度PCR仪(美国Bio-Rad)、普通及倒置显微镜(日本Olympus)、台式低速及高速冷冻离心机(德国Eppendorf)、96孔培养板及25cm培养瓶(美国Corning)、FACScan型流式细胞仪(美国Becton Dickinson)、普通及超低温冰箱、高压灭菌锅、电热恒温干燥箱、微量移液器等。
1.1.2试剂 三氧化二砷购自哈尔滨医科大学药业有限公司,PBS配制成50μmol/L贮存液,4℃保存。RPMI-1640培养基为Gibco公司产品,胎牛血清购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司,青霉素、链霉素、MTT为Amresco公司产品,MTT使用前用PBS稀释为5mg/mL,200目微孔滤膜过滤除菌,4℃避光保存。AnnexinV-F ITC细胞凋亡检测试剂盒为ACT Gene公司产品。Trizol、MMLV第一链cDNA合成试剂盒、PCR扩增试剂盒、DNA marker、引物合成均来自天根生化科技(北京)有限公司。
1.1.3细胞株与细胞培养胃腺癌SGC-7901细胞株由本实验室传代培养,RPMI-1640培养基,含10%胎牛血清,青、链霉素各100 U /mL,37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养,0.25%胰蛋白酶消化传代。细胞解冻复苏后传代2 ~ 3次进入对数生长期。
1.2实验方法
1.2.1细胞增殖及细胞增殖抑制实验采用MTT检测法。取对数生长期SGC-7901细胞,以(5×104)个/mL接种于96孔平底板,每孔接种200μL。37℃、5%CO2、饱和湿度下培养箱培养24h细胞贴壁后,实验组在培养基中加入不同浓度的三氧化二砷,终浓度分别为1、2、4、8、16μmol/L。每组设五个复孔。对照组不加药。另设含有药物的培养液作为本底对照组。分别培养24、48、72h(48h换液一次)后取出,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL,继续培养4h,吸弃孔内上清,每孔加入DMSO 150μL,37℃空气浴振荡器中水平振荡10min至结晶完全溶解,酶标仪上测定各孔A490nm值,记录结果。生长抑制率=(对照组A490nm-实验组A490nm)/对照组A490nm×100%,并以生长抑制率为纵坐标,作用时间为横坐标绘制细胞生长曲线。
1.2.2Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率采用流式细胞仪(FCM)Annexin V/PI双染法检测:取对数生长期细胞,以(1×106)个/孔的密度种植于25cm培养瓶,培养48h细胞贴壁后,加三氧化二砷至不同终浓度,孵育48h后收集所有悬浮及贴壁细胞。1000rpm离心3min弃上清,Annexin V-F ITC 结合液重悬细胞,室温避光孵育10min,离心,弃上清,Annexin V-F ITC结合液重悬细胞,PI冰盒中避光孵育10min,随即上机检测。每组检测10000个细胞。
1.2.3逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测bcl-2、cyclin D1基因转录水平取对数生长期细胞,调整细胞浓度为(1×106)个/mL,接种于25cm培养瓶。分组方法为药物干预组和对照组两大组,其中干预组分别加入浓度为1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L的三氧化二砷。培养48h后,分别收集各组细胞,行RT-PCR检测相关基因的表达。
①总RNA提取:以trizol法提取总RNA,1.2%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计测定A260/A280。确定RNA浓度和纯度,纯度为1.8~2.0。②cDNA 合成:20mL逆转录体系中,含有总RNA1μg,10μM oligo(dT)15 2μL,2.5mMeach dNTP2μL,5×First-Strand Buffer 4μL,0.1M DTT1μL,40U/μLRnase 0.5μL,200 U /μLTIANScript M-MLV 1μL,加ddH2O,至体积20μL。经70℃5min、42℃50min、95℃5min终止反应合成cDNA。③PCR扩增检测bcl-2、cyclin D1基因的表达:PremierPrimer 5设计引物,bcl-2上游引物5’- TTGGATCAGGGAGTTGGAAG- 3’,下游引物5’- TGTCCCTACCAACCAGAAGG-3’,扩增产物295bp;cyclinD1 上游引物5’-CTGGCCAT2GAACTACCTGGA - 3’,下游引物5’-GTCACACTTGATCACTCTGG-3’,扩增产物483bp;β肌动蛋白(β-actin)作内参照,上游引物5’- AAACTGGAACGGTGAAGGTG-3’,下游引物5’-GTGGCTTTT AGGATGGCAAG-3’,扩增产物160bp。PCR反应体系为:25μL,cDNA2μL,10pmol/μL的上下游引物各0. 5μL,10×Taq Buffer2.5μL,2.5mM dNTP Mixture 4μL,2.5U/μL Taq 0.5μL,补ddH2O至体积25μL。94℃预变性3min,94℃30s、58℃30s、72℃60s30个循环。72℃延伸5min。
PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳,以DNA Marker标记确定条带大小。凝胶扫描成像分析系统进行摄像后并对凝胶条带灰度信号强度半定量分析。以bcl-2/β-actin及cyclin D1 /β-actin的比值作为bcl-2、cyclin D1的相对表达强度。
1.3统计学处理
实验数据以(χ±s)表示,采用SPSS13.0软件分析处理数据,连续型变量比较采用t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析,分类变量比较采用卡方检验。P<0.05为统计学上差异有显著性。
2结果
2.1三氧化二砷对细胞增殖活性的影响
MTT结果显示,1μmol/L的三氧化二砷对SGC7901细胞增殖抑制作用较小。2μmol/L以上浓度的三氧化二砷对SGC7901细胞增殖有明显抑制作用,且随药物浓度的提高,作用时间的延长其抑制率也相应增加,见图1。
2.2Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率
Annexin V /P I双染法设立阴性对照,双侧单标,阳性对照。右下象限为早期凋亡部分。双染流式细胞计数结果显示三氧化二砷可以诱导SGC7901细胞早期凋亡,随着三氧化二砷浓度的增高,细胞凋亡数逐渐增高,1μmol/L组与对照组比较细胞凋亡数差异无显著性(P>0.05),而较高浓度组与对照组比较细胞凋亡数差异有显著性(P<0.05)。提示低浓度三氧化二砷(≤1μmol/L)对细胞凋亡无明显意义,而较高浓度的三氧化二砷(≥2μmol/L)与细胞凋亡率具有剂量依赖关系(P<0.05)。见表1、图2。
2.3三氧化二砷对SGC7901细胞bcl-2、cyclin D1基因转录的影响
RT-PCR电泳条带灰度分析半定量比较发现不同浓度的三氧化二砷作用48h后,bcl-2、cyclinD1基因表达下降,并且随着三氧化二砷浓度的增加基因表达下降的程度也增加,见图3。凝胶灰度图像半定量分析bcl-2/β-actin和cyclin D1/β- actin的值:1μmol/L组和对照组相比无明显差异(P>0.05),而在较高浓度其比值有明显差异(P<0.05),见表2。
3讨论
三氧化二砷已被广泛证明是一种治疗急性早幼粒性白血病的有效制剂[4-7]。2000年9月,三氧化二砷被美国食品及药物管理局批准上市。近年来发现三氧化二砷除了能治疗血液系统疾病,对多种恶性实体肿瘤也有强大的抗癌作用。MTT细胞增殖抑制实验证实三氧化二砷对SGC7901细胞具有较强抑制作用。且与作用剂量和作用时间呈正相关。AnnexinV /P I双标法结果显示三氧化二砷作用于SGC7901细胞48h后可诱导细胞进入凋亡,增加药物浓度可以明显提高早期凋亡比率。提示三氧化二砷主要通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤细胞增殖。bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)基因是Bcl基因家族的一个重要成员,该基因是Tsujimoto等[8]于1984年从滤泡性淋巴瘤中(14,18)染色体易位的断裂点克隆到的一个原癌基因。bcl-2作为抑制凋亡的基因,其过表达能延长细胞寿命,使已有DNA受损的细胞生存期延长,以致增加其他基因突变的机会,从而导致肿瘤的发生[9]。细胞周期调控的有序发生和细胞凋亡是保持基因稳定性的两个重要因素,而基因组不稳定性正是肿瘤发生的根本原因之一[10]。细胞周期调节因子包括周期素(cyclin)、细胞周期素依赖性激酶(CDK)和细胞周期素依赖性激酶抑制因子(CDKI),三者组成调控网络,以CDK为核心,cyclin起正调控作用促进细胞增殖,CDKI起负调控作用抑制细胞增殖,共同调节细胞周期演进。cyclin D1基因是近年来提出的重要的原癌基因,其蛋白产物在细胞周期关键限速点G1/S 期转换中起重要正调控作用[11]。Morisaki等[12]报道,胃癌细胞株中cyclin D1的下调,能抑制胃癌细胞的增殖,提示cyclin D1的过度表达能促进胃癌细胞的增殖。
我们的研究发现,三氧化二砷能抑制胃腺癌SGC7901细胞生长,对胃腺癌具有显著的体外增殖抑制作用并诱导细胞发生凋亡,诱导胃腺癌SGC7901细胞凋亡的过程伴随了bcl-2、cyclin D1基因表达的下调,提示三氧化二砷可能通过抑制bcl-2、cyclin D1的表达,诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤增殖。
[参考文献]
[1] 曹琦,韦国桢,郭红荣. 三氧化二砷诱导恶性肿瘤细胞凋亡机制的研究进展[J]. 现代肿瘤医学,2007,15(5):731-734.
[2] Jin M,Inoue S,Umemura T,et al. Cyclin D1,p16 and retinoblastoma gene product expression as a predictor for prognosis in non-small cell lung cancer at stages I and II[J]. Lung Cancer,2001,34(2):207 -218.
[3] 吴晓康,吴育连,郑樟栋. 胰腺癌细胞凋亡与bcl-2,bax基因的表达[J]. 中国普通外科杂志,2002,11(3):171-173.
[4] Pervaiz S. Superoxide znion inhibits drug-induced tumor cell death[J]. FEBS LEBS Lett,1999,459(3):343-348.
[5] FedeeB. Involvement of casepases in neutrophil apoptosis:regulation by reactive oxygen soecies[J]. Blood,1998,92(12):4808-4818.
[6] Thornberry NA,Lazebnik Y. Caspase: ennmies within[J]. Science,1998, 281(5381):1312-1316.
[7] Tom J. A permission of ras-induced apoptosis by the GTPase[J]. Mol Cell Biol,1999,19(9):5892-5901.
[8] Tsujimotoy, Cossman J, Jaffe E, et al. Involement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma[J]. Science,1985, 228(4706):1440- 1443.
[9] 金军,袁宏银,熊金. bag-1、bcl-2在大肠腺瘤和大肠癌中的表达及意义[J]. 肿瘤防治研究,2005,32(5):284-286.
[10] Zhan Q,Kontny U,lglesias M,et al. Inhibitory effect of bel-2 on p53 mediated transactiration following gene toxic stress[J]. Oneongene,1999,18(2):297-304.
[11] Taylor B J,Olson D P,Ivy SP. Detection of P-glycoprotein in cell lines and leukemicblasts:failure of select monoclonal antibodies to detect clinically significant P-gp levels in primary cells[J]. Leuk Res,2001,25(12):1127-1135.
[12] Morisaki T,Uchiyama A,Yuzuki D,et al. Interleukin4 regulates G1 cell cycle progression in gastric carcinoma cells[J]. Cancer Res,1994, 54(4):1113-1118.
(收稿日期:2009-10-26)
[关键词] 胃腺癌;三氧化二砷;细胞凋亡;bcl-2;cyclin D1
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)04-32-03
Arsenic Trioxide-induced SGC7901 Cell Apoptosis and Its Effect on Gene Expression of bcl-2 and cyclin D1
HUANG DefengZHAO ZhiguoMA JunCUI Yi
Department of Gastroenterology,the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450014,China
[Abstract] Objective To investigate the effect of arsenic trioxide on gastric adenocarcinoma cell line SGC7901 cell proliferation,apoptosis,and bcl-2,cyclin D1 gene expression. Methods SGC7901 cells were treated with different concentrations of arsenic trioxide at different time and after that,the proliferation of SGC7901 cells,the apoptosis rate and the gene transcription level of bcl-2 and cyclin D1 were detected by MTT,by flow cytometry and AnnexinV/PI double staining and by RT-PCR,respectively. Results Slightly high concentration of arsenic trioxide(≥2μmol/L) could inhibit cell proliferation and induce SGC-7901 apoptosis, with a dose-and time -dependency. The bcl-2 and cyclin D1 gene expression was obviously lowered in the arsenic trioxide group than that of the control(P<0.01). Conclusion Arsenic trioxide can effectively inhibit cell proliferation and induce SGC7901 apoptosis,with a direct relation to the dose and time,which may be correlated with the inhibition of bcl-2 and cyclin D1 expression by arsenic trioxide.
[Key words] Gastric adenocarcinoma;Arsenic trioxide;Apoptosis;bcl-2;cyclin D1
三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)是中药砒霜的主要有效成分,近年来研究表明,三氧化二砷除了能治疗血液系统疾病,对包括胃癌在内的多种恶性实体瘤也有强大的杀伤作用。胃癌是我国常见的恶性肿瘤,其对放、化疗的敏感性均较低,死亡率高,晚期尚缺乏有效的治疗手段,寻找新的治疗药物和治疗手段乃当务之急。
诱导胃癌细胞凋亡是治疗的新思路。三氧化二砷可以诱导恶性肿瘤细胞凋亡进而抑制肿瘤生长发挥治疗作用,分子机制涉及多个凋亡调控分子[1]。周期素D1(cyclin D1)能激活CDK2、4、5,促进细胞由G1期进入S期,进行DNA合成,使细胞持续性增殖[2]。bcl-2是从滤泡性淋巴瘤中分离出的一种癌基因,也是细胞凋亡抑制因子,具有抑制细胞凋亡、延长细胞寿命的功能[3]。本研究应用三氧化二砷作用于胃腺癌SGC7901细胞,观察三氧化二砷对SGC7901细胞凋亡的影响,以及此过程中bcl-2、cyclin D1基因表达的变化,探讨三氧化二砷诱导胃腺癌SGC7901细胞凋亡的机制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1仪器 CO2培养箱(美国Thermo)、温度梯度PCR仪(美国Bio-Rad)、普通及倒置显微镜(日本Olympus)、台式低速及高速冷冻离心机(德国Eppendorf)、96孔培养板及25cm培养瓶(美国Corning)、FACScan型流式细胞仪(美国Becton Dickinson)、普通及超低温冰箱、高压灭菌锅、电热恒温干燥箱、微量移液器等。
1.1.2试剂 三氧化二砷购自哈尔滨医科大学药业有限公司,PBS配制成50μmol/L贮存液,4℃保存。RPMI-1640培养基为Gibco公司产品,胎牛血清购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司,青霉素、链霉素、MTT为Amresco公司产品,MTT使用前用PBS稀释为5mg/mL,200目微孔滤膜过滤除菌,4℃避光保存。AnnexinV-F ITC细胞凋亡检测试剂盒为ACT Gene公司产品。Trizol、MMLV第一链cDNA合成试剂盒、PCR扩增试剂盒、DNA marker、引物合成均来自天根生化科技(北京)有限公司。
1.1.3细胞株与细胞培养胃腺癌SGC-7901细胞株由本实验室传代培养,RPMI-1640培养基,含10%胎牛血清,青、链霉素各100 U /mL,37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养,0.25%胰蛋白酶消化传代。细胞解冻复苏后传代2 ~ 3次进入对数生长期。
1.2实验方法
1.2.1细胞增殖及细胞增殖抑制实验采用MTT检测法。取对数生长期SGC-7901细胞,以(5×104)个/mL接种于96孔平底板,每孔接种200μL。37℃、5%CO2、饱和湿度下培养箱培养24h细胞贴壁后,实验组在培养基中加入不同浓度的三氧化二砷,终浓度分别为1、2、4、8、16μmol/L。每组设五个复孔。对照组不加药。另设含有药物的培养液作为本底对照组。分别培养24、48、72h(48h换液一次)后取出,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL,继续培养4h,吸弃孔内上清,每孔加入DMSO 150μL,37℃空气浴振荡器中水平振荡10min至结晶完全溶解,酶标仪上测定各孔A490nm值,记录结果。生长抑制率=(对照组A490nm-实验组A490nm)/对照组A490nm×100%,并以生长抑制率为纵坐标,作用时间为横坐标绘制细胞生长曲线。
1.2.2Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率采用流式细胞仪(FCM)Annexin V/PI双染法检测:取对数生长期细胞,以(1×106)个/孔的密度种植于25cm培养瓶,培养48h细胞贴壁后,加三氧化二砷至不同终浓度,孵育48h后收集所有悬浮及贴壁细胞。1000rpm离心3min弃上清,Annexin V-F ITC 结合液重悬细胞,室温避光孵育10min,离心,弃上清,Annexin V-F ITC结合液重悬细胞,PI冰盒中避光孵育10min,随即上机检测。每组检测10000个细胞。
1.2.3逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测bcl-2、cyclin D1基因转录水平取对数生长期细胞,调整细胞浓度为(1×106)个/mL,接种于25cm培养瓶。分组方法为药物干预组和对照组两大组,其中干预组分别加入浓度为1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L的三氧化二砷。培养48h后,分别收集各组细胞,行RT-PCR检测相关基因的表达。
①总RNA提取:以trizol法提取总RNA,1.2%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计测定A260/A280。确定RNA浓度和纯度,纯度为1.8~2.0。②cDNA 合成:20mL逆转录体系中,含有总RNA1μg,10μM oligo(dT)15 2μL,2.5mMeach dNTP2μL,5×First-Strand Buffer 4μL,0.1M DTT1μL,40U/μLRnase 0.5μL,200 U /μLTIANScript M-MLV 1μL,加ddH2O,至体积20μL。经70℃5min、42℃50min、95℃5min终止反应合成cDNA。③PCR扩增检测bcl-2、cyclin D1基因的表达:PremierPrimer 5设计引物,bcl-2上游引物5’- TTGGATCAGGGAGTTGGAAG- 3’,下游引物5’- TGTCCCTACCAACCAGAAGG-3’,扩增产物295bp;cyclinD1 上游引物5’-CTGGCCAT2GAACTACCTGGA - 3’,下游引物5’-GTCACACTTGATCACTCTGG-3’,扩增产物483bp;β肌动蛋白(β-actin)作内参照,上游引物5’- AAACTGGAACGGTGAAGGTG-3’,下游引物5’-GTGGCTTTT AGGATGGCAAG-3’,扩增产物160bp。PCR反应体系为:25μL,cDNA2μL,10pmol/μL的上下游引物各0. 5μL,10×Taq Buffer2.5μL,2.5mM dNTP Mixture 4μL,2.5U/μL Taq 0.5μL,补ddH2O至体积25μL。94℃预变性3min,94℃30s、58℃30s、72℃60s30个循环。72℃延伸5min。
PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳,以DNA Marker标记确定条带大小。凝胶扫描成像分析系统进行摄像后并对凝胶条带灰度信号强度半定量分析。以bcl-2/β-actin及cyclin D1 /β-actin的比值作为bcl-2、cyclin D1的相对表达强度。
1.3统计学处理
实验数据以(χ±s)表示,采用SPSS13.0软件分析处理数据,连续型变量比较采用t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析,分类变量比较采用卡方检验。P<0.05为统计学上差异有显著性。
2结果
2.1三氧化二砷对细胞增殖活性的影响
MTT结果显示,1μmol/L的三氧化二砷对SGC7901细胞增殖抑制作用较小。2μmol/L以上浓度的三氧化二砷对SGC7901细胞增殖有明显抑制作用,且随药物浓度的提高,作用时间的延长其抑制率也相应增加,见图1。
2.2Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率
Annexin V /P I双染法设立阴性对照,双侧单标,阳性对照。右下象限为早期凋亡部分。双染流式细胞计数结果显示三氧化二砷可以诱导SGC7901细胞早期凋亡,随着三氧化二砷浓度的增高,细胞凋亡数逐渐增高,1μmol/L组与对照组比较细胞凋亡数差异无显著性(P>0.05),而较高浓度组与对照组比较细胞凋亡数差异有显著性(P<0.05)。提示低浓度三氧化二砷(≤1μmol/L)对细胞凋亡无明显意义,而较高浓度的三氧化二砷(≥2μmol/L)与细胞凋亡率具有剂量依赖关系(P<0.05)。见表1、图2。
2.3三氧化二砷对SGC7901细胞bcl-2、cyclin D1基因转录的影响
RT-PCR电泳条带灰度分析半定量比较发现不同浓度的三氧化二砷作用48h后,bcl-2、cyclinD1基因表达下降,并且随着三氧化二砷浓度的增加基因表达下降的程度也增加,见图3。凝胶灰度图像半定量分析bcl-2/β-actin和cyclin D1/β- actin的值:1μmol/L组和对照组相比无明显差异(P>0.05),而在较高浓度其比值有明显差异(P<0.05),见表2。
3讨论
三氧化二砷已被广泛证明是一种治疗急性早幼粒性白血病的有效制剂[4-7]。2000年9月,三氧化二砷被美国食品及药物管理局批准上市。近年来发现三氧化二砷除了能治疗血液系统疾病,对多种恶性实体肿瘤也有强大的抗癌作用。MTT细胞增殖抑制实验证实三氧化二砷对SGC7901细胞具有较强抑制作用。且与作用剂量和作用时间呈正相关。AnnexinV /P I双标法结果显示三氧化二砷作用于SGC7901细胞48h后可诱导细胞进入凋亡,增加药物浓度可以明显提高早期凋亡比率。提示三氧化二砷主要通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤细胞增殖。bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)基因是Bcl基因家族的一个重要成员,该基因是Tsujimoto等[8]于1984年从滤泡性淋巴瘤中(14,18)染色体易位的断裂点克隆到的一个原癌基因。bcl-2作为抑制凋亡的基因,其过表达能延长细胞寿命,使已有DNA受损的细胞生存期延长,以致增加其他基因突变的机会,从而导致肿瘤的发生[9]。细胞周期调控的有序发生和细胞凋亡是保持基因稳定性的两个重要因素,而基因组不稳定性正是肿瘤发生的根本原因之一[10]。细胞周期调节因子包括周期素(cyclin)、细胞周期素依赖性激酶(CDK)和细胞周期素依赖性激酶抑制因子(CDKI),三者组成调控网络,以CDK为核心,cyclin起正调控作用促进细胞增殖,CDKI起负调控作用抑制细胞增殖,共同调节细胞周期演进。cyclin D1基因是近年来提出的重要的原癌基因,其蛋白产物在细胞周期关键限速点G1/S 期转换中起重要正调控作用[11]。Morisaki等[12]报道,胃癌细胞株中cyclin D1的下调,能抑制胃癌细胞的增殖,提示cyclin D1的过度表达能促进胃癌细胞的增殖。
我们的研究发现,三氧化二砷能抑制胃腺癌SGC7901细胞生长,对胃腺癌具有显著的体外增殖抑制作用并诱导细胞发生凋亡,诱导胃腺癌SGC7901细胞凋亡的过程伴随了bcl-2、cyclin D1基因表达的下调,提示三氧化二砷可能通过抑制bcl-2、cyclin D1的表达,诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤增殖。
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(收稿日期:2009-10-26)