【摘 要】
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目的 探讨β淀粉样前体蛋白羧基端短肽C31的毒性作用和自噬的关系,以及自噬是否介导C31的清除.方法 首先构建p3 xFLAG—CMV—10—mCherry-C31(C31)质粒和p3xFLAG-CMV-10-mChe
【机 构】
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200025,上海交通大学医学院附属瑞金医院神经内科神经病学研究所
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目的 探讨β淀粉样前体蛋白羧基端短肽C31的毒性作用和自噬的关系,以及自噬是否介导C31的清除.方法 首先构建p3 xFLAG—CMV—10—mCherry-C31(C31)质粒和p3xFLAG-CMV-10-mCherry(Vector)质粒(对照),采用脂质体转染法转染入SH-SY5Y和APPsw稳转的HEK293(APPsw HEK293)细胞系中,并通过Western blot方法验证其表达;采用MTT法检测C31和Vector质粒瞬时转染48 h后的细胞存活率;分别予以不同的自噬调节药物,Western blot检测自噬相关蛋白(LC3)和C31水平.最后,通过免疫共沉淀法检测C31是否可以和LC3结合,并采用免疫荧光检测C31是否可以与LC3共定位,以进一步验证自噬是否为介导C31降解的关键途径.结果 在SH-SY5Y和APPsw HEK293细胞系中,C31质粒转染组细胞活力显著低于对照组(P＜0.05);转染C31组与对照组自噬水平无明显差异;促自噬情况下(雷帕霉素和饥饿处理),LC3—Ⅱ的水平比未加药处理组略增高,但未达到统计学意义,C31水平相对于空载水平差异无统计学意义;自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用于APPsw HEK293细胞后,LC3—Ⅱ水平有轻度降低,但未达到统计学意义,C31水平改变也未达到统计学意义;加入自噬体和溶酶体融合抑制剂氯喹(CQ)和氯化铵(NH4Cl)后,细胞自噬水平有明显的增高,且CQ的作用最为明显,C31水平相对于空载水平明显增高(P＜0.05).在SH—SY5Y细胞中,结果类似,但CQ和NH4Cl作用后,C31水平相对于空载水平无统计学差异.免疫荧光显示C31通过与自噬相关蛋白LC3结合,从而锚定到自噬体上,而参与到自噬代谢过程.结论 C31在SH-SY5Y细胞和APPsw HEK293细胞中均能产生细胞毒性作用.过表达C31不改变细胞的自噬水平.自噬途径介导C31的清除,表明自噬可能在阿尔茨海默病中起到保护作用.
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