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摘 要：为建立高效的大荔冬枣无病毒苗组培快繁体系，以大荔冬枣茎段腋芽作为外植体，MS为基础培养基，研究不同消毒组合对其外植体的消毒效果以及不同植物生长调节剂组合对丛生芽诱导、增殖的影响。结果表明，大荔冬枣茎端经75%酒精处理30s，0.1%HgCl2消毒11min，消毒效果最佳，污染率最低且无死亡;不同激素配比对大荔冬枣茎段腋芽的萌发均有一定的促进作用，且差异极显著（P<0.01），在MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L的培养条件下丛生芽诱导率最高，为83.33%。研究结果可以为大荔冬枣无毒苗的选育和获取及其规模化繁殖提供理论基础和技术支持。
关键词：大荔冬枣;快繁;丛生芽;诱导
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）10-0023-03
枣（Ziziphus jujuba Mill）为鼠李科枣属植物，原产于中国，是我国具有代表性的古老特色果树之一[1]。枣树适应性强，在我国分布面积广，大面积种植主要集中在河北、山东、河南、陕西等地，这几个省份的栽培面积和产量占全国的90%左右[2]。因各地环境与土壤条件的不同，生产出枣的品质也存在一定的差异。大荔冬枣是陕西省大荔县特有的冬枣品种，果实中的维生素A、维生素E、cAMP、钾、钠、铁、铜等含量均较高，不仅具有保持毛细血管畅通、防止血管壁脆性增加的功能，而且对预防高血压、动脉粥样硬化病症也有一定的效果。
目前，大荔冬枣的育苗方式一直采用较为传统的无性繁殖，主要包括分蘖法、嫁接法和扦插法，这几种繁殖方法不仅生产出的幼苗存活率低，而且育苗周期长[3]，在急需大规模繁殖且种源较少的情况下，继续使用传统无性繁殖方法，将会限制大荔冬枣的大规模推广，且会失去很好的市场机会。传统无性繁殖无法去除新生苗体内的病毒，使一些有害病毒代代相传，危害日益严重，如病毒引起的枣疯病[4]以枣树为介质传播的，对枣树有毁灭性危害，所有枣树栽培区几乎都存在。而植物组织培养技术不仅可以在短期内快速大量繁殖，并且可以彻底去除母体内的病毒。
為此，笔者首次采用植物组织培养技术，研究不同消毒组合对大荔冬枣外植体消毒效果的影响以及不同植物生长调节剂组合对丛生芽诱导、增殖的影响，以期为大荔冬枣无毒苗的选育和获取以及规模化繁殖提供理论基础和技术支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料 大荔冬枣采自陕西省大荔县冬枣种植园，采当年新生枝条为外植体材料。
1.2 实验方法
1.2.1 外植体消毒 将采集的枣树枝条洗净，剪成1～2cm带腋芽的小茎段，放入干净烧杯中，用蒸馏水冲洗30min后75%乙醇消毒30s，蒸馏水冲洗3～5次，再用0.1%HgCl2分别消毒3、5、7、9、11min，蒸馏水冲洗5次。用剪刀剪去外植体茎段两侧与消毒液接触部位，接种于芽诱导培养基中：MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L。每组接种6个，培养10后观察其污染情况。培养条件：温度（25±2）℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d。
1.2.2 大荔冬枣丛定芽的诱导 将消毒完成的茎段接种至以MS培养基为基础培养基[5]，添加6-BA（0.5、1.0、2.0mg/L）和NAA（0.05、0.1、0.2mg/L）共9组不同激素配比的芽诱导培养基中。其培养基成分为：MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+6-BA+NAA。每组接种20个，分别于培养5、15、30d时观察其生长状况。培养条件：温度（25±2）℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d。丛生芽诱导率（%）=（诱导的丛生芽数/接种的茎段数）×100。
1.2.3 数据处理 对所得数据进行SPSS 19.0进行方差分析及多重比较分析。
2 结果与分析
2.1 不同消毒时间对大荔冬枣外植体消毒效果的影响 由表1可知，在接种数相同的条件下，外植体污染率与死亡率随0.1%HgCl2消毒时间的增加而逐渐降低。以0.1%HgCl2消毒3min时，外植体污染率最高（100%），且死亡率最大（100%）;0.1%HgCl2消毒11min时，外植体污染率最小（16.7%），并且没有死亡外植体，死亡率为0。因此，大荔冬枣外植体经75%酒精处理30s后，再经0.1%HgCl2消毒11min，消毒效果最佳，污染率最低且无死亡，为最佳消毒组合。
2.2 不同激素浓度组合对丛生芽诱导的影响 外植体消毒后接种至由6-BA和NAA组成的不同激素浓度的芽诱导培养基中，培养5d左右，大荔冬枣茎段出现圆球状小芽（图1A），随后不断突起变大（图1B），同时茎段逐渐枯萎死亡，15d后统计其各激素梯度的芽诱导情况。由表2和表3可知，不同浓度NAA与6-BA激素组合对大荔冬枣丛生芽均有诱导效果，无论是6-BA、NAA或6-BA和NAA的组合均具有极显著影响效果（P<0.01）。当6-BA浓度为1mg/L时，丛生芽诱导率随NAA浓度的增加而逐渐降低;当6-BA浓度为2mg/L时，随着NAA浓度的增加，诱导率逐渐升高;当6-BA浓度为1.5mg/L时随着着NAA浓度的升高，诱导率先降低后升高。在设计的9个处理中，以处理9的丛生芽诱导效果最佳，诱导率达83.33%;其次是处理1、处理2和处理8，诱导率均达50%以上，但处理1与处理2和处理8之间差异达极显著水平（P<0.01），说明6-BA和NAA不同浓度组合对大荔冬枣丛生芽诱导存在一定差异。因此，芽诱导的最适培养基为MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA。
3 讨论与结论
枣树外植体进行丛生芽诱导较为困难[6]，因而其外植体诱导丛生芽的报道相对较少。徐化凌[5]利用沾化冬枣新生嫩枝进行丛生芽诱导及植株再生研究，结果表明，分化效果最好的基础培养基是MS培养基以及丛生芽诱导最适激素配比;罗晓芳[7]以良种金丝小枣的不同组织作为外植体，筛选出最佳培养基，使其快速繁殖实用化。 植物外植体的表面与内部携带有大量的微生物[8]，在植物组织培养中，外植体消毒是至关重要的一步。由于外植体种类的不同，其消毒时间也有一定的差异。万国平[9]等进行骏枣外植体消毒时，首先用70%酒精浸泡处理30s，其次无菌水冲洗后用0.1%氯化汞消毒5～10min，与本实验所得大荔冬枣外植体最佳消毒结果稍有差距，本实验所得75%酒精消毒30s，其后0.1%氯化汞进行消毒11min时消毒结果最佳。这种结果是由于不同品种枣树含有微生物不同还是由于试验所采集外植体生长程度不同造成的，需进行下一步的深入研究。氯化汞是一种毒性物质，本实验在消毒组合方面只研究了其消毒效果，其消毒时间对外植体是否存在损伤以及对芽诱导是否存在影响需进一步探讨。
研究表明，外源植物生产调节剂对植物体快速繁殖起着重要作用，生长素类激素有利于外植体进行根的诱导与生长，细胞分裂素类激素有利于外植体进行芽的分化与生长，此两者的类型与浓度配比对植物外植体器官的再分化诱导至关重要[10]。本实验选取NAA与6-BA作为外源激素，并设置9组浓度梯度组合，分析其对大荔冬枣外植体丛生芽的诱导作用。结果表明，在设计的9个处理中，以处理9的丛生芽诱导效果最佳且诱导率最高（83.33%）;其次是处理1、处理2和处理8，诱导率均达50%以上，但处理1与处理2和处理8之间差异达极显著水平（P<0.01），说明6-BA和NAA不同浓度组合对大荔冬枣丛生芽诱导存在一定差异，不同激素浓度配比对外植体虽都有诱导作用但诱导情况不相同。易双双[11]等研究表明，当6-BA浓度为1.0mg/L、NAA浓度增加时，丛生芽诱导率呈先上升后下降的趋势;当6-BA浓度为2.0mg/L时，丛生芽诱导率随NAA浓度的增加呈逐渐降低的趋势。这与本实验所得结果存在差异，这可能是由于所采外植体不同造成，也可能是所采用的激素的批次不同造成的。因此，今后在研究丛生芽诱导时，应采用同一批次的激素进行试验，以减少激素所带来的误差;采用同一时期采取的外植体进行芽诱导对比，以减少外植体采取状况不同所带来的影响。
参考文献
[1]王娇，王玖瑞，赵锦，等.枣疯病带病组培苗的离体器官再生[J].河北农业大学学报，2016，39（5）：51-56.
[2]任继海.枣树管理与红枣贮藏加工[M].北京：中国科学技术出版社，1998：1-5
[3]刘秀君.不同枣树品种组织培养快速繁殖比较研究[D].晋中：山西农业大学，2003.
[4]王娇，王玖瑞，赵锦，等.枣疯病带病组培苗的离体器官再生[J].河北农业大学学报，2016，39（5）：51-56.
[5]徐化凌，陈纪香，于德花，等.沾化冬枣组培快繁技术研究[J].山东林业科技，2003（5）：29-30.
[6]李云，王宇，田砚亭，等.赞皇大枣叶片再生植株的初步研究[J].核农学报，2003，17（3）：187-190.
[7]罗晓芳，田砚亭，李云，等.金丝小枣组织培养快速繁殖的研究[J].北京林业大学学报，1996（2）：9-15.
[8]郑文静，赵海岩，杨立国.植物组织培养操作过程中的常见问题及其解决办法[J].辽宁农业科学，2001（2）：49-51.
[9]王国平，李晓梅，陈秋芳.枣不定芽再生体系的研究[J].中国农学通报，2006，22（4）：281-283.
[10]XUMIAO-YUN SUN Q Z.Buds Induction and High-frequency Plant Regeneration of Salivia miltiorrhiza Bunge[J].Journal of Agricultural Science & Technology，2008，10：76-80.
[11]易双双，陆顺教，冷青云，等.树兰茎段丛生芽快繁体系的建立[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2016，44（12）：157-162. （责編：张宏民）
关键词：大荔冬枣;快繁;丛生芽;诱导
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）10-0023-03
枣（Ziziphus jujuba Mill）为鼠李科枣属植物，原产于中国，是我国具有代表性的古老特色果树之一[1]。枣树适应性强，在我国分布面积广，大面积种植主要集中在河北、山东、河南、陕西等地，这几个省份的栽培面积和产量占全国的90%左右[2]。因各地环境与土壤条件的不同，生产出枣的品质也存在一定的差异。大荔冬枣是陕西省大荔县特有的冬枣品种，果实中的维生素A、维生素E、cAMP、钾、钠、铁、铜等含量均较高，不仅具有保持毛细血管畅通、防止血管壁脆性增加的功能，而且对预防高血压、动脉粥样硬化病症也有一定的效果。
目前，大荔冬枣的育苗方式一直采用较为传统的无性繁殖，主要包括分蘖法、嫁接法和扦插法，这几种繁殖方法不仅生产出的幼苗存活率低，而且育苗周期长[3]，在急需大规模繁殖且种源较少的情况下，继续使用传统无性繁殖方法，将会限制大荔冬枣的大规模推广，且会失去很好的市场机会。传统无性繁殖无法去除新生苗体内的病毒，使一些有害病毒代代相传，危害日益严重，如病毒引起的枣疯病[4]以枣树为介质传播的，对枣树有毁灭性危害，所有枣树栽培区几乎都存在。而植物组织培养技术不仅可以在短期内快速大量繁殖，并且可以彻底去除母体内的病毒。
為此，笔者首次采用植物组织培养技术，研究不同消毒组合对大荔冬枣外植体消毒效果的影响以及不同植物生长调节剂组合对丛生芽诱导、增殖的影响，以期为大荔冬枣无毒苗的选育和获取以及规模化繁殖提供理论基础和技术支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料 大荔冬枣采自陕西省大荔县冬枣种植园，采当年新生枝条为外植体材料。
1.2 实验方法
1.2.1 外植体消毒 将采集的枣树枝条洗净，剪成1～2cm带腋芽的小茎段，放入干净烧杯中，用蒸馏水冲洗30min后75%乙醇消毒30s，蒸馏水冲洗3～5次，再用0.1%HgCl2分别消毒3、5、7、9、11min，蒸馏水冲洗5次。用剪刀剪去外植体茎段两侧与消毒液接触部位，接种于芽诱导培养基中：MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L。每组接种6个，培养10后观察其污染情况。培养条件：温度（25±2）℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d。
1.2.2 大荔冬枣丛定芽的诱导 将消毒完成的茎段接种至以MS培养基为基础培养基[5]，添加6-BA（0.5、1.0、2.0mg/L）和NAA（0.05、0.1、0.2mg/L）共9组不同激素配比的芽诱导培养基中。其培养基成分为：MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+6-BA+NAA。每组接种20个，分别于培养5、15、30d时观察其生长状况。培养条件：温度（25±2）℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d。丛生芽诱导率（%）=（诱导的丛生芽数/接种的茎段数）×100。
1.2.3 数据处理 对所得数据进行SPSS 19.0进行方差分析及多重比较分析。
2 结果与分析
2.1 不同消毒时间对大荔冬枣外植体消毒效果的影响 由表1可知，在接种数相同的条件下，外植体污染率与死亡率随0.1%HgCl2消毒时间的增加而逐渐降低。以0.1%HgCl2消毒3min时，外植体污染率最高（100%），且死亡率最大（100%）;0.1%HgCl2消毒11min时，外植体污染率最小（16.7%），并且没有死亡外植体，死亡率为0。因此，大荔冬枣外植体经75%酒精处理30s后，再经0.1%HgCl2消毒11min，消毒效果最佳，污染率最低且无死亡，为最佳消毒组合。
2.2 不同激素浓度组合对丛生芽诱导的影响 外植体消毒后接种至由6-BA和NAA组成的不同激素浓度的芽诱导培养基中，培养5d左右，大荔冬枣茎段出现圆球状小芽（图1A），随后不断突起变大（图1B），同时茎段逐渐枯萎死亡，15d后统计其各激素梯度的芽诱导情况。由表2和表3可知，不同浓度NAA与6-BA激素组合对大荔冬枣丛生芽均有诱导效果，无论是6-BA、NAA或6-BA和NAA的组合均具有极显著影响效果（P<0.01）。当6-BA浓度为1mg/L时，丛生芽诱导率随NAA浓度的增加而逐渐降低;当6-BA浓度为2mg/L时，随着NAA浓度的增加，诱导率逐渐升高;当6-BA浓度为1.5mg/L时随着着NAA浓度的升高，诱导率先降低后升高。在设计的9个处理中，以处理9的丛生芽诱导效果最佳，诱导率达83.33%;其次是处理1、处理2和处理8，诱导率均达50%以上，但处理1与处理2和处理8之间差异达极显著水平（P<0.01），说明6-BA和NAA不同浓度组合对大荔冬枣丛生芽诱导存在一定差异。因此，芽诱导的最适培养基为MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA。
3 讨论与结论
枣树外植体进行丛生芽诱导较为困难[6]，因而其外植体诱导丛生芽的报道相对较少。徐化凌[5]利用沾化冬枣新生嫩枝进行丛生芽诱导及植株再生研究，结果表明，分化效果最好的基础培养基是MS培养基以及丛生芽诱导最适激素配比;罗晓芳[7]以良种金丝小枣的不同组织作为外植体，筛选出最佳培养基，使其快速繁殖实用化。 植物外植体的表面与内部携带有大量的微生物[8]，在植物组织培养中，外植体消毒是至关重要的一步。由于外植体种类的不同，其消毒时间也有一定的差异。万国平[9]等进行骏枣外植体消毒时，首先用70%酒精浸泡处理30s，其次无菌水冲洗后用0.1%氯化汞消毒5～10min，与本实验所得大荔冬枣外植体最佳消毒结果稍有差距，本实验所得75%酒精消毒30s，其后0.1%氯化汞进行消毒11min时消毒结果最佳。这种结果是由于不同品种枣树含有微生物不同还是由于试验所采集外植体生长程度不同造成的，需进行下一步的深入研究。氯化汞是一种毒性物质，本实验在消毒组合方面只研究了其消毒效果，其消毒时间对外植体是否存在损伤以及对芽诱导是否存在影响需进一步探讨。
研究表明，外源植物生产调节剂对植物体快速繁殖起着重要作用，生长素类激素有利于外植体进行根的诱导与生长，细胞分裂素类激素有利于外植体进行芽的分化与生长，此两者的类型与浓度配比对植物外植体器官的再分化诱导至关重要[10]。本实验选取NAA与6-BA作为外源激素，并设置9组浓度梯度组合，分析其对大荔冬枣外植体丛生芽的诱导作用。结果表明，在设计的9个处理中，以处理9的丛生芽诱导效果最佳且诱导率最高（83.33%）;其次是处理1、处理2和处理8，诱导率均达50%以上，但处理1与处理2和处理8之间差异达极显著水平（P<0.01），说明6-BA和NAA不同浓度组合对大荔冬枣丛生芽诱导存在一定差异，不同激素浓度配比对外植体虽都有诱导作用但诱导情况不相同。易双双[11]等研究表明，当6-BA浓度为1.0mg/L、NAA浓度增加时，丛生芽诱导率呈先上升后下降的趋势;当6-BA浓度为2.0mg/L时，丛生芽诱导率随NAA浓度的增加呈逐渐降低的趋势。这与本实验所得结果存在差异，这可能是由于所采外植体不同造成，也可能是所采用的激素的批次不同造成的。因此，今后在研究丛生芽诱导时，应采用同一批次的激素进行试验，以减少激素所带来的误差;采用同一时期采取的外植体进行芽诱导对比，以减少外植体采取状况不同所带来的影响。
参考文献
[1]王娇，王玖瑞，赵锦，等.枣疯病带病组培苗的离体器官再生[J].河北农业大学学报，2016，39（5）：51-56.
[2]任继海.枣树管理与红枣贮藏加工[M].北京：中国科学技术出版社，1998：1-5
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[5]徐化凌，陈纪香，于德花，等.沾化冬枣组培快繁技术研究[J].山东林业科技，2003（5）：29-30.
[6]李云，王宇，田砚亭，等.赞皇大枣叶片再生植株的初步研究[J].核农学报，2003，17（3）：187-190.
[7]罗晓芳，田砚亭，李云，等.金丝小枣组织培养快速繁殖的研究[J].北京林业大学学报，1996（2）：9-15.
[8]郑文静，赵海岩，杨立国.植物组织培养操作过程中的常见问题及其解决办法[J].辽宁农业科学，2001（2）：49-51.
[9]王国平，李晓梅，陈秋芳.枣不定芽再生体系的研究[J].中国农学通报，2006，22（4）：281-283.
[10]XUMIAO-YUN SUN Q Z.Buds Induction and High-frequency Plant Regeneration of Salivia miltiorrhiza Bunge[J].Journal of Agricultural Science & Technology，2008，10：76-80.
[11]易双双，陆顺教，冷青云，等.树兰茎段丛生芽快繁体系的建立[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2016，44（12）：157-162. （责編：张宏民）