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【摘要】 目的:探讨外源性p21waf1基因转染对人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖的影响。方法:用脂质体介导的方法将pIRES-p21waf1真核表达载体转染人胃癌细胞系BGC-823,分为pIRES-p21waf1轉染组、pIRES-neo空载体组及未转染组三个组别。应用实时荧光定量RT-PCR、Western blot免疫印迹分别在基因和蛋白两个水平检测各组p21的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖能力,流式细胞仪分析细胞DNA周期变化,所有数据进行统计学分析。结果:p21waf1转染组p21waf1 mRNA和p21蛋白高表达(P<0.01);p21waf1转染组BGC-823细胞生长速度明显低于空载体组和未转染组(P<0.01);流式细胞仪观察到p21waf1转染组细胞的G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组(P<0.01),S期比例显著低于空载体组和未转染组(P<0.01),并出现凋亡峰。结论:p21waf1基因转染可以抑制人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖并能诱导其发生细胞凋亡,可能为胃癌的基因治疗提供一条新的途径。
【关键词】 基因转染; p21waf1; 细胞增殖; 胃癌
p21waf1为野生型p53激活片段(wild-type p53 activated fragment 1,WAF1),它为单拷贝基因,是一种非常重要的抑癌基因,也是目前研究热点[1]。它作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)家族成员,是细胞周期蛋白(cyclin)与细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)的广泛抑制剂,主要参与细胞周期调控[2]。已有研究证实,p21waf1基因突变或缺失与胃癌、食管癌、膀胱癌、乳腺癌、胆管癌等恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关,以及通过改变p21waf1基因的表达可以起到调节肿瘤生长的作用[3-5]。因此,本研究将外源性p21waf1基因转染到人胃癌细胞系BGC-823中,使其稳定表达后,来研究其对人胃癌细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料 pIRES-p21waf1真核表达载体、人胃癌细胞系BGC-823(由青岛大学医学院附属医院中心实验室构建并惠赠),基因转染试剂盒(QIAGEN公司),Trizol试剂、DMEM-高糖培养基(Invitrogen公司),RT-PCR试剂盒(Takara公司),p21waf1及3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物及各自Taqman探针(由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供),鼠抗人p21waf1单克隆抗体(Santa Cruz公司),兔抗鼠二抗、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(QIAGEN公司)。
1.2 细胞培养方法 人胃癌细胞系BGC-823培养条件为含10%胎牛血清的DMEM-高糖完全培养液,37 ℃、5%CO2饱和湿度孵箱中孵育。倒置相差显微镜观察细胞形态,取对数生长期细胞进行相关实验。
1.3 基因转染条件和方法 参照QIAGEN转染试剂盒说明书进行。采用24孔板转染细胞,分三个组,分别为pIRES-p21waf1转染组、pIRES-neo空载体组、未转染组。
1.4 p21waf1 mRNA表达的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞,按照Trizol试剂盒说明提取总RNA。p21waf1基因引物设计:上游:5’-GGACAGCAGAGCACC
1.5 p21waf1蛋白表达的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞,提取细胞总蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,进行一抗(鼠抗人p21单克隆抗体)、二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗)孵育和显色,曝光并照相。使用HPIAS-1000型全自动图像分析仪分析蛋白条带灰度值。
1.6 细胞增殖能力的检测 各组均取对数生长期的细胞,采用经典的MTT法检测后,绘制细胞生长曲线,分析各组细胞的增殖能力。
1.7 细胞周期分布的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞,各约1×106个细胞,加入终浓度70%冷乙醇,4 ℃固定24 h,PBS洗涤离心三遍,加入Rnase酶(2 mg/ml)于37 ℃水浴30 min,再加碘化丙啶(25 mg/ml)染色,4 ℃避光20 min,经尼龙网滤过后,上流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况。
1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包进行处理,计量资料以(x±s)表示,两组间比较采用t 检验,计数资料采用 字2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.3 p21waf1基因转染对胃癌细胞BGC-823细胞增殖的影响 MTT证明,p21 waf1转染组胃癌细胞系BGC-823的增殖速度明显要低于空载体组、未转染组,p21waf1转染组在生长5 d后出现增殖速度减慢,而空载体组及未转染组则表现出持续增殖的态势,差异有统计学意义(P<0.01)。而空载体组及未转染组两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组p21waf1蛋白表达见图3。
3 讨论
据众多研究表明,细胞周期失去控制是肿瘤细胞恶性增殖重要原因之一[6]。Cyclin-CDKs-CKI共同构成了细胞增殖的内源性调控系统,其中Cyclin对CDKs有正性调控作用,CKI则起负性调控作用。Cyclins与其相对应CDKs结合成cyclins-CDKs复合物后可以起到激活CDKs作用,对特定底物磷酸化,从而促进细胞周期演变、启动DNA的合成、促进细胞分裂等重要功能[7]。p21waf1作为一种重要的CKI,可与多种cyclins-CDKs复合物结合(如CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2、CyclinD-CDK4等)并抑制CDKs对特定底物的磷酸化作用。另一方面,p21waf1的C端还是DNA复制必需因子-增殖细胞核抗原(PCNA)结合域,其与PCNA结合后,阻碍其与DNA聚合酶结合成全酶复合物,从而在DNA复制过程中,阻止了全酶复合物在DNA单链上的滑动,使DNA得复制不能继续进行[8]。p21通过结合并起到对CDKs和PCNA的双重抑制,最终均导致细胞在增殖过程中,停滞在细胞周期G1/S关键点,并诱导细胞凋亡,进而抑制了细胞的继续无限增殖周期[8]。 本研究将外源性p21waf1基因转染人胃癌细胞系BGC-823中后,p21waf1转染细胞组,p21waf1mRNA和p21waf1蛋白均高表達;p21waf1转染组BGC-823细胞生长速度低于空载体组和未转染组;流式细胞仪观察到p21waf1蛋白高表达使BGC-823细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞数目明显要多于空载体组和未转染组,而S期细胞数则明显要低于空载体组和未转染组,并出现凋亡峰。笔者认为,外源性p21waf1基因转染且稳定表达后,可能通过p21waf1-cyclins-CDKs途径,起到对CDKs和PCNA的活性的双重抑制,进而使癌细胞DNA合成及细胞周期演进受阻,最终导致癌细胞增殖活性明显降低,大量停滞于G1期。根据本文结果,笔者认为,外源性p21waf1基因转染可以抑制人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖和促进细胞凋亡,将来可能为研究胃癌的治疗方法提供一条新的思路。
参考文献
[1] 张志平,王洲,刘相燕,等.RNA激活上调p21waf1/CIP1基因表达对胃癌细胞增殖和凋亡影响的研究[J].中华肿瘤防治杂志,2011,18(14):1080-1083.
[2] Gartel,A L,Tyner,A L.The role of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 in Apoptosis[J].Mol Cancer Ther,2002,(1)1:639-649.
[3] 张学彦,景德怀,刘志强,等.p21waf1基因对人食管鳞癌细胞增殖的抑制作用[J].世界华人消化杂志,2009,17(14):1384-1389.
[4] 刘卫梅.p21在食管癌组织中的表达及临床意义[J].肿瘤基础与临床,2007,20(2):173-174.
[5] 王贵英,王士杰,李勇,等.细胞周期调控因子与癌发生的关系[J].国外医学:肿瘤学分册,2005,32(1):14-16.
[6] Shapiro,G I.Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment[J].J Clin Onco1,2006,24(1):1770-1783.
[7] Chen J,Jackson P K,Kirschner M W,et al.Separate domains of p21 involved in the inhibition of Cdk kinase and PCNA[J].Nature,1995,374(1):386-388.
[8] Yang K,Zheng X Y,Qin J,et a1.Up-regulation of p21WAF1/Ciplby saRNA induces G1-phase arrest and apoptosis in T24 human bladder cancer cells[J].Cancer Lett,2008,265(1):206-214.
(收稿日期:2012-08-27) (本文编辑:连胜利)
【关键词】 基因转染; p21waf1; 细胞增殖; 胃癌
p21waf1为野生型p53激活片段(wild-type p53 activated fragment 1,WAF1),它为单拷贝基因,是一种非常重要的抑癌基因,也是目前研究热点[1]。它作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)家族成员,是细胞周期蛋白(cyclin)与细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)的广泛抑制剂,主要参与细胞周期调控[2]。已有研究证实,p21waf1基因突变或缺失与胃癌、食管癌、膀胱癌、乳腺癌、胆管癌等恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关,以及通过改变p21waf1基因的表达可以起到调节肿瘤生长的作用[3-5]。因此,本研究将外源性p21waf1基因转染到人胃癌细胞系BGC-823中,使其稳定表达后,来研究其对人胃癌细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料 pIRES-p21waf1真核表达载体、人胃癌细胞系BGC-823(由青岛大学医学院附属医院中心实验室构建并惠赠),基因转染试剂盒(QIAGEN公司),Trizol试剂、DMEM-高糖培养基(Invitrogen公司),RT-PCR试剂盒(Takara公司),p21waf1及3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物及各自Taqman探针(由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供),鼠抗人p21waf1单克隆抗体(Santa Cruz公司),兔抗鼠二抗、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(QIAGEN公司)。
1.2 细胞培养方法 人胃癌细胞系BGC-823培养条件为含10%胎牛血清的DMEM-高糖完全培养液,37 ℃、5%CO2饱和湿度孵箱中孵育。倒置相差显微镜观察细胞形态,取对数生长期细胞进行相关实验。
1.3 基因转染条件和方法 参照QIAGEN转染试剂盒说明书进行。采用24孔板转染细胞,分三个组,分别为pIRES-p21waf1转染组、pIRES-neo空载体组、未转染组。
1.4 p21waf1 mRNA表达的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞,按照Trizol试剂盒说明提取总RNA。p21waf1基因引物设计:上游:5’-GGACAGCAGAGCACC
1.5 p21waf1蛋白表达的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞,提取细胞总蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,进行一抗(鼠抗人p21单克隆抗体)、二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗)孵育和显色,曝光并照相。使用HPIAS-1000型全自动图像分析仪分析蛋白条带灰度值。
1.6 细胞增殖能力的检测 各组均取对数生长期的细胞,采用经典的MTT法检测后,绘制细胞生长曲线,分析各组细胞的增殖能力。
1.7 细胞周期分布的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞,各约1×106个细胞,加入终浓度70%冷乙醇,4 ℃固定24 h,PBS洗涤离心三遍,加入Rnase酶(2 mg/ml)于37 ℃水浴30 min,再加碘化丙啶(25 mg/ml)染色,4 ℃避光20 min,经尼龙网滤过后,上流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况。
1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包进行处理,计量资料以(x±s)表示,两组间比较采用t 检验,计数资料采用 字2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.3 p21waf1基因转染对胃癌细胞BGC-823细胞增殖的影响 MTT证明,p21 waf1转染组胃癌细胞系BGC-823的增殖速度明显要低于空载体组、未转染组,p21waf1转染组在生长5 d后出现增殖速度减慢,而空载体组及未转染组则表现出持续增殖的态势,差异有统计学意义(P<0.01)。而空载体组及未转染组两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组p21waf1蛋白表达见图3。
3 讨论
据众多研究表明,细胞周期失去控制是肿瘤细胞恶性增殖重要原因之一[6]。Cyclin-CDKs-CKI共同构成了细胞增殖的内源性调控系统,其中Cyclin对CDKs有正性调控作用,CKI则起负性调控作用。Cyclins与其相对应CDKs结合成cyclins-CDKs复合物后可以起到激活CDKs作用,对特定底物磷酸化,从而促进细胞周期演变、启动DNA的合成、促进细胞分裂等重要功能[7]。p21waf1作为一种重要的CKI,可与多种cyclins-CDKs复合物结合(如CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2、CyclinD-CDK4等)并抑制CDKs对特定底物的磷酸化作用。另一方面,p21waf1的C端还是DNA复制必需因子-增殖细胞核抗原(PCNA)结合域,其与PCNA结合后,阻碍其与DNA聚合酶结合成全酶复合物,从而在DNA复制过程中,阻止了全酶复合物在DNA单链上的滑动,使DNA得复制不能继续进行[8]。p21通过结合并起到对CDKs和PCNA的双重抑制,最终均导致细胞在增殖过程中,停滞在细胞周期G1/S关键点,并诱导细胞凋亡,进而抑制了细胞的继续无限增殖周期[8]。 本研究将外源性p21waf1基因转染人胃癌细胞系BGC-823中后,p21waf1转染细胞组,p21waf1mRNA和p21waf1蛋白均高表達;p21waf1转染组BGC-823细胞生长速度低于空载体组和未转染组;流式细胞仪观察到p21waf1蛋白高表达使BGC-823细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞数目明显要多于空载体组和未转染组,而S期细胞数则明显要低于空载体组和未转染组,并出现凋亡峰。笔者认为,外源性p21waf1基因转染且稳定表达后,可能通过p21waf1-cyclins-CDKs途径,起到对CDKs和PCNA的活性的双重抑制,进而使癌细胞DNA合成及细胞周期演进受阻,最终导致癌细胞增殖活性明显降低,大量停滞于G1期。根据本文结果,笔者认为,外源性p21waf1基因转染可以抑制人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖和促进细胞凋亡,将来可能为研究胃癌的治疗方法提供一条新的思路。
参考文献
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[2] Gartel,A L,Tyner,A L.The role of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 in Apoptosis[J].Mol Cancer Ther,2002,(1)1:639-649.
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[5] 王贵英,王士杰,李勇,等.细胞周期调控因子与癌发生的关系[J].国外医学:肿瘤学分册,2005,32(1):14-16.
[6] Shapiro,G I.Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment[J].J Clin Onco1,2006,24(1):1770-1783.
[7] Chen J,Jackson P K,Kirschner M W,et al.Separate domains of p21 involved in the inhibition of Cdk kinase and PCNA[J].Nature,1995,374(1):386-388.
[8] Yang K,Zheng X Y,Qin J,et a1.Up-regulation of p21WAF1/Ciplby saRNA induces G1-phase arrest and apoptosis in T24 human bladder cancer cells[J].Cancer Lett,2008,265(1):206-214.
(收稿日期:2012-08-27) (本文编辑:连胜利)