【摘 要】
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目的:构建人颗粒溶素(Granulysin,GNLY)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:抽提体外培养的单个核细胞总RNA,通过RT-PCR的方法获得含有222bp的颗粒溶素cDNA,克隆到pMD18
【机 构】
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第二军医大学长征医院实验诊断科全军临床免疫中心; 第二军医大学长征医院实验诊断科全军临床免疫中心 上海200003; 上海200003;
【基金项目】
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国家自然科学基金(30471616);上海市重大科技攻关基金(04DZ19116);上海市重点科研支撑条件项目(051409012);上海市青年科技启明星计划(QMX01423)资助
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目的:构建人颗粒溶素(Granulysin,GNLY)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:抽提体外培养的单个核细胞总RNA,通过RT-PCR的方法获得含有222bp的颗粒溶素cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-GNLY,在大肠杆菌中诱导表达并经Ni亲和层析纯化。用SDS-PAGE和Westernblot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GNLY融合蛋白的生物学活性。结果:酶切结果证实,成功地构建了GN-LY原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致。结论:成功构建了重组表达质粒pET28a(+)-GNLY,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达,获得了具有良好的抗原性和特异性的GNLY融合蛋白,为下一步研究人GNLY的功能奠定了基础。
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