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[摘要]目的：研究结缔组织生长因子(CTGF)在病理性瘢痕组织中的表达定位，以探讨其在病理性瘢痕中的作用及与病理性瘢痕形成的关系。方法：分别留取正常皮肤2例、浅表性瘢痕3例、增生性瘢痕、增生性瘢痕边缘正常皮肤、瘢痕疙瘩及瘢痕疙瘩边缘正常皮肤各5例组织标本，用特异性抗体作为标记物，用胶体金作示踪物进行免疫电镜观察，观察标记物所在位置，以了解在不同组织中表达水平的差异性。结果：CTGF在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩边缘正常皮肤中的表达均明显高于正常皮肤、浅表性瘢痕及增生性瘢痕边缘正常皮肤。免疫电镜标记显示成纤维细胞细胞超微结构清晰，金颗粒呈团状、点灶状分布，特异性强，CTGF蛋白阳性标记主要位于粗面内质网，粗面内质网核糖体、胶原纤维、细胞外基质、桥粒连接、常染色质等部位也有表达。结论：CTGF与病理性瘢痕的形成有相关性，在其发病过程中可能发挥重要作用。
[关键词]结缔组织生长因子(CTGF)：病理性瘢痕；免疫电镜；胶体金
[中图分类号]R392.11 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)07－0871－03
临床上常见的病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是皮肤对创伤、炎症、烧伤应激的一种过度的皮肤纤维增生性疾病，其形成原因至今尚未完全探明。随着研究的深入，人们渐渐认识到结缔组织生长因子(connective tissue growth fac－tor，CTGF)与病理性瘢痕密切相关。阐明CTGF在病理性瘢痕中的表达特点、分布规律、病理性瘢痕中超微结构特点等一系列问题将对最终揭示瘢痕的形成机制等提供科学的依据。本实验通过应用特异性抗体作为标记物，用胶体金作示踪物进行免疫电镜观察，观察标记物所在位置，以分析比较标记物在不同组织中表达水平的差异性，探讨CTGF的表达与病理性瘢痕形成的相关性。
1 材料和方法
1．1 标本来源及实验分组：瘢痕疙瘩的诊断参照1991年James标准，且均属于增生期。病例入选标准还包括：2年内未接受药物注射、放射或外科治疗：1个月内未予任何外用药治疗；无系统疾病者。无局部皮肤病变。标本均来源于潍坊市人民医院美容整形科。总共有标本15例，其中男6例，女9例：年龄18－48岁，平均(30±14)岁；病程1－20年，平均(5.28±4.02)年。瘢痕疙瘩及增生性瘢痕各5例，浅表性瘢痕组3例，正常皮肤对照组2例(均取自健康个体躯干上部)。实验分6组：NS组(正常皮肤组)、SS组(浅表性瘢痕组)、HS组(增生性瘢痕组)、HSN组(增生性瘢痕边缘外正常皮肤组)和K组(瘢痕疙瘩组)、KN组(瘢痕疙瘩边缘外正常皮肤组)。
1．2 主要试剂与仪器：兔抗人CTGF多克隆抗体、即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。lOnm胶体金标记羊抗兔IgG及山羊血清封闭液购自北京博奥森生物技术公司。电镜为日本产H－7500型透射电镜。
1．3 免疫电镜胶体金标记：取新鲜各组标本各取5例组织，修成lmm3大小，0.25％戊二醛(0.1mol/L，pH7.4二甲砷酸钠缓冲液配制)4℃固定2h，不经锇酸固定，常规脱水Epon812包埋，聚合(37℃：12h，45℃:24h)，70nm超薄切片捞于无支持膜的200目不锈刚网上。①10％H2O2，10mim双蒸水3×2min；TBS(pH7.4，Tris－HCI缓冲液)，3×2min；②1:20的羊血清白蛋白封闭30mim③兔抗人CTGF多克隆抗体，1:50，4℃冰箱过夜；④室温复温1h，pH7.4TBS喷洗，5×3min；pH8.2TBS(含1％BSA)洗，3×2mim⑤10nm金标羊抗兔IgG，室温2h；⑥pH8.2TBS洗，5×3mimpH 7.4TBS洗3×3mim⑦1％戊二醛固定15min，双蒸水洗2次；⑦醋酸双氧铀10min，枸橼酸铅5min，复染。用TBS代替一抗作空白对照，其他步骤相同，透射电镜观察。
2 结果
胶体金标记的阳性信号为电镜下所见的致密、规则、反差比较大的、高电子密度圆形或近圆形颗粒。阴性对照无此颗粒。
电镜下：瘢痕与正常皮肤细胞超微结构清晰，保存良好。瘢痕超微结构显示以成纤维细胞的改变最显著，成纤维细胞数量多、细胞体积大、胞浆丰富，胞浆内有发达的细胞器，主要是大量扩张的粗面内质网。细胞核亦增大，核质丰富，核仁明显。所有6组标本中均出现了胶体金标记CTGF阳性颗粒，金颗粒呈圆形，电子密度高而清晰。在表达定量指标上，与免疫组化中的表达结果基本一致(另文发表)。在表达定位指标上有所区别，在正常皮肤和浅表性瘢痕、增生性瘢痕边缘正常皮肤组织中金颗粒表达较少，金颗粒呈点灶状分布。在正常皮肤主要位于基底细胞中的粗面内质网，真皮乳头层有散在少量表达；在浅表性瘢痕组织中表达亦较少，主要定位于基底细胞中的粗面内质网，在成纤维细胞粗面内质网及细胞外基质有散在少量表达；在增生性瘢痕边缘正常皮肤组织中，金颗粒主要见于成纤维细胞粗面内质网，胶原原纤维及细胞外基质有散在少量表达。在瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩边缘正常皮肤和增生性瘢痕组织中，胶体金颗粒表达明显增多，金颗粒呈团状、点灶状分布，标记主要位于成纤维细胞粗面内质网，此外，粗面内质网核糖体、胶原原纤维、细胞外基质、桥粒连接、常染色质等部位也有表达，聚集的胶体金颗粒清楚可见，特异性强，最多的一团金颗粒达上百枚。空白对照组细胞内未见CTGF特异性金标颗粒。
3 讨论
3．1 近年来国内外学者对病理性瘢痕的发病机制从细胞因了、微循环、免疫、胶原代谢、基因表达、细胞增殖及调亡、氧自由基等各方面进行了深入的研究，但是任何一个单的因素都不能完整解释病理性瘢痕的发病机制，普遍的观点认为病理性瘢痕是多种因素共同作用的结果。目前所知与外伤、烧伤、于术、感染、异物、机体局部胶原代谢失调、遗传及局部免疫功能等多种因素有关。其中细胞因子是众多学者研究的重点，深入研究相关因子，可能为最终揭示病理性瘢痕的发病机制和生物学治疗提供依据。
3．2 CTGF是一种新发现的细胞因子，被视为转化生长因子-β，(TGF-β，)的下游反应元件，它的上述作用已在多种纤维化疾病的研究中得到证实。在瘢痕形成过程的体内和体外实验研究中，CTGF对成纤维细胞的分化增殖，具有很强的调控作用，而CTGF的异常高表达在瘢痕形成过程的发生、发展过程中起着关键作用，已成为瘢痕形成过程新的研究热点。在间允质细胞中CTGF可以快速选择性的被TGF-β2诱导。研究发现TGF-β2可以直接激活CTGF基因的转录，在CTGF的启动子序列128－162的位置上存在着一个重要的TGF-β2调控元件，后者的点突变可以导致TGF-β2活性的完全丧失。故认为CTGF是TGF-β2致纤维化作用的下游效应介质，能够调节细胞外基质基因的表达。
3．3 本实验用特异性抗体作为标记物，用胶体金作示踪物进行免疫电镜观察，观察标记物所在位置，发现CTGF主要定位于瘢痕成纤维细胞胞浆中的粗面内质网，这同免疫组化研究CTGF主要定位于成纤维细胞胞浆相一致。粗面内质网核糖体、胶原纤维、细胞外基质、桥粒连接等部位也有表达。也有定位于核内、常染色质。在正常皮肤中免疫组化见CTGF呈弱阳性表达，主要在表皮基底层细胞。而免疫电镜下CTGF主要在基底细胞有阳性表达颗粒，在成纤维细胞胞浆中的粗面内质网仅有少量表达，这可能与CTGF在正常皮肤表达较弱有关。而在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕甚至在瘢痕疙瘩边缘正常皮肤中表达均较正常皮肤、浅表性瘢痕、增生性瘢痕边缘正常皮肤明显增强，说明这些组织纤维增生活跃，该结果显示瘢痕疙瘩与增生性瘢痕既有纤维增生活跃的共同特性，又有区别。增生性瘢痕边缘正常皮肤与正常皮肤、浅表性瘢痕表达基本相同，预示其治疗效果要明显好于瘢痕疙瘩患者，这与临床治疗效果基本一致。CTGF阳性颗粒为何出现在粗面内质网内，推测这与粗面内质网功能特性有关，粗面内质网的主要功能就是合成细胞外基质等分泌性蛋白。在病理情况下，细胞外基质分泌过多，从而可引起细胞外基质沉积，导致瘢痕形成。
3．4 人CTGF做为一种具有潜在应用意义的细胞因子，发现于20世纪90年代前期，其作用机理等基础工作仍需深入。CTGF是一种重要的促纤维化因子，作为TGF/SMADs途径的下游介质参与病理性瘢痕的形成。通过阻断CTGF可能减轻TGF-β诱导组织纤维化的效应，同时保留TGF-β有利的抗炎症和抗肿瘤细胞增生的效应。CTGF的分泌失调可能与病理性瘢痕的发生和进展有极为密切的关系，调控瘢痕局部CTGF的表达，对延缓瘢痕进展，可能有积极意义。
[关键词]结缔组织生长因子(CTGF)：病理性瘢痕；免疫电镜；胶体金
[中图分类号]R392.11 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)07－0871－03
临床上常见的病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是皮肤对创伤、炎症、烧伤应激的一种过度的皮肤纤维增生性疾病，其形成原因至今尚未完全探明。随着研究的深入，人们渐渐认识到结缔组织生长因子(connective tissue growth fac－tor，CTGF)与病理性瘢痕密切相关。阐明CTGF在病理性瘢痕中的表达特点、分布规律、病理性瘢痕中超微结构特点等一系列问题将对最终揭示瘢痕的形成机制等提供科学的依据。本实验通过应用特异性抗体作为标记物，用胶体金作示踪物进行免疫电镜观察，观察标记物所在位置，以分析比较标记物在不同组织中表达水平的差异性，探讨CTGF的表达与病理性瘢痕形成的相关性。
1 材料和方法
1．1 标本来源及实验分组：瘢痕疙瘩的诊断参照1991年James标准，且均属于增生期。病例入选标准还包括：2年内未接受药物注射、放射或外科治疗：1个月内未予任何外用药治疗；无系统疾病者。无局部皮肤病变。标本均来源于潍坊市人民医院美容整形科。总共有标本15例，其中男6例，女9例：年龄18－48岁，平均(30±14)岁；病程1－20年，平均(5.28±4.02)年。瘢痕疙瘩及增生性瘢痕各5例，浅表性瘢痕组3例，正常皮肤对照组2例(均取自健康个体躯干上部)。实验分6组：NS组(正常皮肤组)、SS组(浅表性瘢痕组)、HS组(增生性瘢痕组)、HSN组(增生性瘢痕边缘外正常皮肤组)和K组(瘢痕疙瘩组)、KN组(瘢痕疙瘩边缘外正常皮肤组)。
1．2 主要试剂与仪器：兔抗人CTGF多克隆抗体、即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。lOnm胶体金标记羊抗兔IgG及山羊血清封闭液购自北京博奥森生物技术公司。电镜为日本产H－7500型透射电镜。
1．3 免疫电镜胶体金标记：取新鲜各组标本各取5例组织，修成lmm3大小，0.25％戊二醛(0.1mol/L，pH7.4二甲砷酸钠缓冲液配制)4℃固定2h，不经锇酸固定，常规脱水Epon812包埋，聚合(37℃：12h，45℃:24h)，70nm超薄切片捞于无支持膜的200目不锈刚网上。①10％H2O2，10mim双蒸水3×2min；TBS(pH7.4，Tris－HCI缓冲液)，3×2min；②1:20的羊血清白蛋白封闭30mim③兔抗人CTGF多克隆抗体，1:50，4℃冰箱过夜；④室温复温1h，pH7.4TBS喷洗，5×3min；pH8.2TBS(含1％BSA)洗，3×2mim⑤10nm金标羊抗兔IgG，室温2h；⑥pH8.2TBS洗，5×3mimpH 7.4TBS洗3×3mim⑦1％戊二醛固定15min，双蒸水洗2次；⑦醋酸双氧铀10min，枸橼酸铅5min，复染。用TBS代替一抗作空白对照，其他步骤相同，透射电镜观察。
2 结果
胶体金标记的阳性信号为电镜下所见的致密、规则、反差比较大的、高电子密度圆形或近圆形颗粒。阴性对照无此颗粒。
电镜下：瘢痕与正常皮肤细胞超微结构清晰，保存良好。瘢痕超微结构显示以成纤维细胞的改变最显著，成纤维细胞数量多、细胞体积大、胞浆丰富，胞浆内有发达的细胞器，主要是大量扩张的粗面内质网。细胞核亦增大，核质丰富，核仁明显。所有6组标本中均出现了胶体金标记CTGF阳性颗粒，金颗粒呈圆形，电子密度高而清晰。在表达定量指标上，与免疫组化中的表达结果基本一致(另文发表)。在表达定位指标上有所区别，在正常皮肤和浅表性瘢痕、增生性瘢痕边缘正常皮肤组织中金颗粒表达较少，金颗粒呈点灶状分布。在正常皮肤主要位于基底细胞中的粗面内质网，真皮乳头层有散在少量表达；在浅表性瘢痕组织中表达亦较少，主要定位于基底细胞中的粗面内质网，在成纤维细胞粗面内质网及细胞外基质有散在少量表达；在增生性瘢痕边缘正常皮肤组织中，金颗粒主要见于成纤维细胞粗面内质网，胶原原纤维及细胞外基质有散在少量表达。在瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩边缘正常皮肤和增生性瘢痕组织中，胶体金颗粒表达明显增多，金颗粒呈团状、点灶状分布，标记主要位于成纤维细胞粗面内质网，此外，粗面内质网核糖体、胶原原纤维、细胞外基质、桥粒连接、常染色质等部位也有表达，聚集的胶体金颗粒清楚可见，特异性强，最多的一团金颗粒达上百枚。空白对照组细胞内未见CTGF特异性金标颗粒。
3 讨论
3．1 近年来国内外学者对病理性瘢痕的发病机制从细胞因了、微循环、免疫、胶原代谢、基因表达、细胞增殖及调亡、氧自由基等各方面进行了深入的研究，但是任何一个单的因素都不能完整解释病理性瘢痕的发病机制，普遍的观点认为病理性瘢痕是多种因素共同作用的结果。目前所知与外伤、烧伤、于术、感染、异物、机体局部胶原代谢失调、遗传及局部免疫功能等多种因素有关。其中细胞因子是众多学者研究的重点，深入研究相关因子，可能为最终揭示病理性瘢痕的发病机制和生物学治疗提供依据。
3．2 CTGF是一种新发现的细胞因子，被视为转化生长因子-β，(TGF-β，)的下游反应元件，它的上述作用已在多种纤维化疾病的研究中得到证实。在瘢痕形成过程的体内和体外实验研究中，CTGF对成纤维细胞的分化增殖，具有很强的调控作用，而CTGF的异常高表达在瘢痕形成过程的发生、发展过程中起着关键作用，已成为瘢痕形成过程新的研究热点。在间允质细胞中CTGF可以快速选择性的被TGF-β2诱导。研究发现TGF-β2可以直接激活CTGF基因的转录，在CTGF的启动子序列128－162的位置上存在着一个重要的TGF-β2调控元件，后者的点突变可以导致TGF-β2活性的完全丧失。故认为CTGF是TGF-β2致纤维化作用的下游效应介质，能够调节细胞外基质基因的表达。
3．3 本实验用特异性抗体作为标记物，用胶体金作示踪物进行免疫电镜观察，观察标记物所在位置，发现CTGF主要定位于瘢痕成纤维细胞胞浆中的粗面内质网，这同免疫组化研究CTGF主要定位于成纤维细胞胞浆相一致。粗面内质网核糖体、胶原纤维、细胞外基质、桥粒连接等部位也有表达。也有定位于核内、常染色质。在正常皮肤中免疫组化见CTGF呈弱阳性表达，主要在表皮基底层细胞。而免疫电镜下CTGF主要在基底细胞有阳性表达颗粒，在成纤维细胞胞浆中的粗面内质网仅有少量表达，这可能与CTGF在正常皮肤表达较弱有关。而在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕甚至在瘢痕疙瘩边缘正常皮肤中表达均较正常皮肤、浅表性瘢痕、增生性瘢痕边缘正常皮肤明显增强，说明这些组织纤维增生活跃，该结果显示瘢痕疙瘩与增生性瘢痕既有纤维增生活跃的共同特性，又有区别。增生性瘢痕边缘正常皮肤与正常皮肤、浅表性瘢痕表达基本相同，预示其治疗效果要明显好于瘢痕疙瘩患者，这与临床治疗效果基本一致。CTGF阳性颗粒为何出现在粗面内质网内，推测这与粗面内质网功能特性有关，粗面内质网的主要功能就是合成细胞外基质等分泌性蛋白。在病理情况下，细胞外基质分泌过多，从而可引起细胞外基质沉积，导致瘢痕形成。
3．4 人CTGF做为一种具有潜在应用意义的细胞因子，发现于20世纪90年代前期，其作用机理等基础工作仍需深入。CTGF是一种重要的促纤维化因子，作为TGF/SMADs途径的下游介质参与病理性瘢痕的形成。通过阻断CTGF可能减轻TGF-β诱导组织纤维化的效应，同时保留TGF-β有利的抗炎症和抗肿瘤细胞增生的效应。CTGF的分泌失调可能与病理性瘢痕的发生和进展有极为密切的关系，调控瘢痕局部CTGF的表达，对延缓瘢痕进展，可能有积极意义。