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目的建立液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定血清25-羟基维生素D2[25(OH)D2]及25-羟基维生素D3[25(OH)D3]含量的方法。方法采用乙醇沉淀蛋白,正己烷液液萃取目标组分,乙腈复溶。采用LCMS/MS[正离子电喷雾离子化(ESI+)的多反应监测模式(MRM)]氘代同位素内标法检测血清25(OH)D2及25(OH)D3含量并进行相关方法学验证。结果 LC-MS/MS检测血清25(OH)D2及25(OH)D3的批内精密度为0.88%~7.69%,批间精密度为1.56%~9.90%;25(OH)D2在0.5~10.0 ng/m L、25(OH)D3在5~100 ng/m L范围内线性良好,线性相关系数分别为0.999 1、0.999 9,校准品测试结果正确度为95.5%~101.2%。281名志愿者男、女之间25(OH)D2含量差异无统计学意义(P>0.05),25(OH)D3含量差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LC-MS/MS检测血清25(OH)D2及25(OH)D3的敏感性高,结果准确、稳定,可应用于临床分析。