【摘 要】
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目的 利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼rpl15基因,探讨rpl15基因对斑马鱼红系造血发育的影响.方法 针对斑马鱼rpl15基因设计并制备gRNA(guide RNA),将gRNA与Cas9蛋白的混合物显
【机 构】
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550004贵阳,贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室,基础医学院免疫学教研室,贵州省再生医学重点实验室;550004贵阳,中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室
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目的 利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼rpl15基因,探讨rpl15基因对斑马鱼红系造血发育的影响.方法 针对斑马鱼rpl15基因设计并制备gRNA(guide RNA),将gRNA与Cas9蛋白的混合物显微注射到单细胞期斑马鱼受精卵中,提取72 h胚胎基因组DNA,PCR扩增出目的片段,T7E1限制性酶切法检测基因打靶情况,随后进行测序分析确定编辑效果.通过O-dianisidine染色分析血红蛋白合成情况,中性粒细胞染色分析中性粒细胞生成情况,利用Real-time PCR检测p53、mdm2、hsp70和造血相关转录因子基因的表达变化.结果 成功制备了rpl15 gRNA,并筛选得到rpl15突变体.rpl15基因敲除的幼鱼出现体长缩短、尾部弯曲、头部和眼睛较小及心包水肿的表型;造血相关谱系染色结果显示rpl15突变体血红蛋白合成明显减少,但中性粒细胞生成未受影响;rpl15突变体p53和mdm2的mRNA表达均显著升高(P＜0.01,P＜0.05,),α-globin、gatal和hsp70的mRNA表达均显著下调(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05),除红系外的造血相关转录因子的mRNA表达与对照组相比均无明显差异.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功编辑了斑马鱼rpl15基因,突变体产生了类似先天性纯红细胞再生障碍性贫血疾病的表型.同时表明p53与hsp70可能参与调控突变体表型的形成.
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