FoxO3腺病毒载体的构建及对脑缺血损伤中自噬相关蛋白的影响

来源 :南通大学学报(医学版) | 被引量 : 0次 | 上传用户:jipeng4610190
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目的:构建转录因子FoxO3的过表达腺病毒载体AV-FoxO3,包装产生高滴度腺病毒;观察其感染氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)损伤小鼠海马细胞系HT22细胞自噬相关蛋白表达的影响。方法:在Gen Bank中查询FoxO3基因及其上下游的序列,设计合成引物并在引物中引入HA序列,逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)体外扩增目的基因,用限制性内切酶NheⅠ-HF和Af1Ⅱ双酶切表达载体p AdenoEF1-BGH-MCMV-EGFP-3FLAG,使用无缝克隆试剂盒将目的基因构建进表达载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取转化子进行菌落PCR鉴定获得阳性克隆(FoxO3重组质粒)并测序;利用Ad Max系统在HEK293A细胞中分别包装FoxO3重组质粒与对照质粒,得到AV-FoxO3和CMV-GFP-A.D.并测定病毒滴度;用AV-FoxO3和CMV-GFP-A.D.感染HT22细胞,荧光显微镜观察感染是否成功,Western Blot检测HT22细胞中HA蛋白(重组FoxO3序列中所含的标签蛋白)的表达;Western Blot检测OGD损伤HT22细胞中自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达。结果:菌落PCR和测序结果均表明FoxO3重组质粒构建成功;与辅助质粒共包装感染细胞获得腺病毒颗粒,测定滴度分别为6.32×1010 Ifu/m L和4×1011Ifu/m L;荧光观察及Western Blot检测均说明AV-FoxO3成功地感染了HT22细胞;FoxO3过表达促进自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达。结论:AV-FoxO3构建成功并可用于HT22细胞的感染,增加细胞内FoxO3表达;FoxO3参与调控自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达。
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