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摘 要：目的：探討间歇运动激活心梗 （myocardial infarction， MI） 大鼠肾脏miR-34a/SIRT1/Trx-1通路抑制肾脏氧化应激反应改善肾脏功能的作用。方法：3月龄雄性SD大鼠，随机分为假手术组 （Sham）、心肌梗死组 （MI）和心梗+间歇有氧运动组（ME），每组12只。MI组采用心脏左冠状动脉前降支 （LAD） 结扎法建立MI模型。Sham组大鼠实施假手术，ME 组大鼠在MI 手术后1周进行4周跑台运动。ME组适应性训练1周 （10～15 m/min，30 min/d，共5 d）。正式训练起始速度10 min×10 m/min （40%～50% VO2 max） 热身，以7 min×25 m/min（85%～90% VO2 max） 和3 min×15 m/min （ 50%～60% VO2 max）交替进行大中等强度间歇运动。总时间为60 min，每周训练5 d，连续训练4 w。训练结束后次日取材，测定各组大鼠心电图变化，采用紫外分光光度法测定肾脏MDA含量、T-AOC和GSH-Px活性，ELISA法测定肾脏LDH活性、血清Trx-1水平以及血清和尿液NAG水平，RT-qPCR 检测肾脏miR-34a和Trx-1表达变化，Western Blot 检测肾脏SIRT1、SOD1、SOD2、NOX2和NOX4蛋白表达。结果：与Sham组比较，MI组大鼠肾脏MDA含量和LDH活性显著增加，T-AOC和GSH-Px活性显著降低;肾脏miR-34a表达显著增加，SIRT1、SOD1和SOD2表达显著减少，NOX2和NOX4表达显著增加;肾脏Trx-1 mRNA表达增多，血清Trx-1水平升高，血清及尿液NAG表达显著升高。与MI组比较，间歇运动显著降低MI大鼠肾脏MDA含量和LDH活性，增加T-AOC和GSH-Px活性，上调SIRT1、SOD1、SOD2和Trx-1的表达，抑制NOX2、NOX4和miR-34a表达，降低血清及尿液NAG表达。血清 Trx-1与NAG表达呈显著正相关;肾脏SIRT1蛋白表达与NOX2、NOX4、MDA和LDH表达呈显著负相关;与SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表达呈显著正相关。肾脏miR-34a表达与SIRT1表达呈显著负相关， 与MDA和LDH蛋白表达呈显著正相关，与SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表达呈显著负相关。结论：间歇运动抑制MI大鼠肾脏miR-34a表达，激活其下游SIRT1/Trx-1调控的NOX4信号通路。表明，miR-34a/SIRT1/Trx-1信号通路在间歇运动抑制心梗大鼠肾脏氧化应激中发挥重要作用。
关键词：间歇运动; 心肌梗死; 氧化应激; miR-34a; SIRT1
中图分类号：G804.2 文献标识码：A 文章编号：1006-2076（2020）06-0044-10
Abstract： Objective：To determine the effects of aerobic interval training （AIT） on the expressions of microRNA-34a （miR-34a）， SIRT1 and Trx-1 and renal oxidative stress in rats with myocardial infarction （MI）. Methods：male Sprague Dawley rats were randomly divided into Sham-operated group （Sham）， Sedentary MI group （MI） and MI with AIT group （ME） （n=12）. The MI model was established by ligation the left anterior descending coronary artery（LAD）. Rats in ME were subjected to 8 weeks treadmill exercise training. （AIT：60 min/day with 10 min of warm-up at 10 m/min （40%～50%VO2 max） and 50 min of exercise at 25 m/min 7 min （85%～90% VO2 max） interspersed with 3 min at 15 m/min （ 50%～60% VO2 max））. After training renal function was evaluated. The levels of renal MDA content， T-AOC and GSH-Px activity by ultraviolet spectrophotometry. The activity of LDH in renal was determined by microplate assay. The levels of serumrx-1and serum， urine NAG were assessed by ELISA. The expression of renal miR-34a， Trx-1 was examined by RT-q PCR. The expression of renal SIRT1 protein was examined by western blotting. Results：Compared with the Sham group， MI increased the expression of renal MDA， LDH， NOX2， NOX4， Trx-1 mRNA and the level of serum Trx-1， serum and urine NAG， and the expression of renal miR-34a. Meanwhile， MI inhibited the expression of renal T-AOC， GSH-Px， SIRT1， SOD1 and SOD2. Compared with the MI group， AIT inhibited the expression of renal MDA， LDH， NOX2， NOX4， serum and urine NAG and the expression of renal miR-34a. Meanwhile， AIT up-regulated the expression of renal T-AOC， GSH-Px， SIRT1， SOD1， SOD2 and renal Trx-1 mRNA and the level of serum Trx-1. The serum level of Trx-1 was positively related to the level of NAG. The expression of SIRT1 protein was negatively related to the expression of NOX2， NOX4， MDA and LDH， and positively related to the xpression of SOD1， SOD2， T-AOC and GSH-Px. The expression of miR-34a was negatively related to the expression of SIRT1， SOD1， SOD2， T-AOC and GSH-Px protein， and positively related to the expression of MDA and LDH. Conclusion：AIT inhibits the level of renal miR-34a， activates the downstream SIRT1/Trx-1 regulated NOX4 signaling pathway. It shows that the miR-34a/ SIRT1/Trx-1 signaling pathway plays an important role in the inhibition of AIT on oxidative stress in the kidneys of rats with myocardial infarction. Key words： aerobic interval training; myocardial infarction; oxidative stress; miR-34a; SIRT1
众所周知，心肌梗死（myocardial infarction，MI）心输出量减少，肾脏血流连续减少，诱发肾脏氧化应激和炎症反应[1～2]，导致急性肾脏损伤（acute kidney injury，AKI），继发肾功能紊乱。研究证实，氧化应激是AKI的主要决定因素，氧化应激水平升高与NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX） 活化有关，其是生成活性氧的主要酶体[3]。NADPH氧化酶家族有7种亚型，分别是NOX1-5以及2种双氧化酶DUOX-1和DUOX-2，其中NOX4是肾脏中的主要形式，NOX2也同时表达[4]。研究发现，NOXs上调表达在肾脏氧化应激和肾脏损伤中发挥重要作用[5]，肾脏缺血缺氧诱发NOX2和NOX4表达增加，氧化应激增强，细胞凋亡增多，而抑制NOX4表达可显著减少肾脏缺血导致的氧化应激和细胞凋亡，减缓肾脏损伤[6]。 提示，NOX4是肾脏氧化应激损伤进程的重要靶点。大量研究证实，有氧运动增强抗氧化能力并减弱正常及疾病大鼠肾脏氧化应激[7-8]。有氧运动可显著减少MI大鼠肾脏脂质过氧化，增强肾脏抗氧化能力[7]，减轻高盐饮食引起的肾脏氧化应激[8]。另有研究证实，间歇运动较有氧运动更有效保护肾脏功能[9-10]。但间歇运动是否抑制MI大鼠肾脏NOX4表达，抑制肾脏氧化应激，目前尚无文献报道。
研究证实，多种生物分子和信号通路影响氧化应激。microRNAs（miRs）通过抑制mRNA转录或促进mRNA降解，成为许多生物进程的调节者[11]，其作为信号分子参与肾脏损伤发生机制与病理生理过程。体内外研究证实，肾脏损伤后miR-27a-3p和miR-320等表达水平与肾脏氧化应激水平同步上调，抑制其表达可显著减轻肾脏氧化应激反应，减少肾脏损伤[12-13]。提示，miRs可作为肾脏疾病的生物标记物和/或潜在治疗靶点。miR-34家族成员miR-34a在氧化应激[14]、炎症[15]和细胞凋亡[16]中起重要作用，且证实直接靶向NAD +依赖性核III类组蛋白去乙酰化酶sirtuin 1（SIRT1）[17]。已知SIRT1通过去乙酰化或与几种靶蛋白相互作用来抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡而发挥肾脏保护作用[18]。体内外实验研究证实，肾毒性大鼠、小鼠及肾脏细胞中miR-34a表达增加，SIRT1表达降低，氧化应激水平升高[19]。另研究证实，硫氧还蛋白-1 （Thioredoxin-1， Trx-1），一种具有氧化还原/炎症调节特性且普遍存在的硫醇蛋白，通过抑制氧化应激保护代谢综合征心血管功能[20]和横纹肌溶解相关急性肾损伤的肾脏功能[21]。研究发现，SIRT1上调表达显著增加衣霉素诱导近端肾小管细胞和内质网应激小鼠肾小管中Trx的表达，抑制肾脏氧化应激[22]。表明，miR-34a/ SIRT1介导的Trx-1信号传导是控制肾脏氧化应激的重要途径。研究证实，运动通过调控miRs表达参与肾脏生理病理进程[23-24]。但运动是否激活MI肾脏miR-34a/SIRT1/Trx-1信号通路，抑制氧化应激反应，保护肾脏功能，目前尚无文献报道。因此，本研究拟探讨间歇运动对MI大鼠肾脏miR-34a和氧化应激的影响及其可能機制，为运动改善MI的病理进程及其机制探讨和相关治疗靶点筛选提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
主要试剂：TRIzol（购于Inventragtion）、反转录试剂盒（购于TAKARA）、兔抗多克隆抗体SIRT1（购于Bioworld）、兔抗单克隆抗体超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 1、SOD2、NOX2和NOX4（购于Abcam）、PCR引物（购于上海生工）、ELISA试剂盒（购于美国R&D公司）、氧化应激试剂盒丙二醛（malondialdehyde，MDA）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）（购于南京建成生物科技有限公司）等。
主要仪器： PowerLab 8/30生理信号采集系统、Bio-Rad电泳仪和转移槽、Bio-Rad凝胶成像系统、BX51奥林巴斯光学显微镜、Thermo低温高速离心机、尼康荧光显微镜、Bio-Rad PCR扩增仪等。
1.2 动物分组与MI模型制备
动物分组：3月龄雄性SD大鼠36只 （购自西安交通大学医学院实验动物中心，动物质量合格证号：陕医动证字SCXK2012-098），体重180～220 g，国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，自由饮食。动物室内温度为20℃～29℃，湿度为50%～60%。动物随机分为假手术组 （Sham组）、心肌梗死组 （MI组）和心梗+间歇有氧运动组 （ME组），每组12只。Sham组大鼠常规笼内安静饲养，MI 组采用左冠状动脉前降支 （ LAD） 结扎法，制备MI 模型。ME 组进行为期4周的小动物跑台运动。
MI模型制备：5%戊巴比妥钠腹腔麻醉，采用大鼠呼吸面罩进行呼吸机辅助呼吸 （60次/min，潮气量16 mL，呼吸比1∶2），多道生理信号采集处理系统记录大鼠肢导心电图 （ECG）。开胸暴露心脏，于左心耳根部和肺动脉圆锥左缘交界下2 mm 处用5/0手术线结扎左冠状动脉前降支（LAD），结扎后肉眼可见结扎远端心肌颜色逐渐变浅或变白，主要局限在LV，靠近心尖部最为明显。利用心电图监测评价MI模型，大鼠MI 后心电图出现S-T段抬高或T波倒置现象。由此断定MI模型造模成功。然后逐层缝合关胸。为了排除手术因素干扰，Sham组大鼠手术过程同上，但仅穿线而不结扎LAD。ME组大鼠在MI模型成功后1 周开始训练。 1.3 间歇有氧运动方案
运动方案参考Wisloff训练模型[25]。ME组大鼠术后1周进行跑台运动。适应性训练1周 （10～15 m/min，30 min/d，共5 d）。正式训练起始速度10 min×10 m/min （40%～50%VO2max） 热身，以7 min×25 m/min（85%～90% VO2max） 和3 min×15 m/min（50%～60%VO2 max）交替进行大中等强度间歇运动。总时间为60 min，每周训练5 d，连续训练4 w。上述运动方案无大鼠死亡。
1.4 样本处理及生化指标测定
4周运动结束后次日，测定心电图，腹主动脉取血及膀胱取尿后，迅速摘取肾脏，液氮骤冷，转移至-80℃超低温冰箱保存备用。
血液及尿液样本离心后弃沉淀留取上清液，严格参照试剂盒说明对肾脏MDA、LDH、T-AOC、GSH-Px进行测定;运用ELISA法，严格按照试剂盒（R&D公司）操作步骤对血清Trx-1及血清和尿液中N-乙酸-β-D-葡萄糖苷酶（N-acetyl-beta-D-glucosaminidase， NAG）的含量进行测定。
1.5 Western Blot
采用RIPA提取肾脏总蛋白质，Bradford法测定蛋白浓度。10～12% SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离后，转至PVDF膜，3% BSA室温摇床封闭1 h后，分别加入兔抗多克隆抗体SIRT1 （1∶400）、兔抗单克隆抗体SOD1（1∶50 000）、SOD2（1∶5000）、NOX2（1∶5000）、NOX4（1∶5000），4℃过夜，室温复温30 min后，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗抗体 （1∶10 000） 孵育1 h，TBST清洗，ECL发光。内参为GAPDH （1∶8000）。
1.6 RT-qPCR
用TRIzol试剂提取肾脏总RNA，严格按照反转录试剂盒说明书操作步骤反转录合成cDNA，后进行RT-qPCR反应，内参为GAPDH。引物序列如下：Trx-1上游引物：5′-CTG ATCGAGAGCAAGGAAGC-3′，下游引物：5′-TCA AGGAACACCACATTGGA-3′，扩增产物长度为158 bp;GAPDH 上游引物：5′-ACAGCAA CAGGGT GGT GGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，扩增产物为252 bp。反应条件如下：95℃ 10 min，1 循环;95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 循环;72℃ 10 min。每个样品重复检测3次。利用2-△△Ct法计算相对基因表达量。
用TRIzol试剂提取肾脏总RNA，按microRNA反转录试剂盒说明书方法反转录合成cDNA，再以此cDNA为模板按PCR试剂盒进行PCR反应。引物和探针由宝生物工程有限公司（TaKaRa）设计和合成，U6为内参。反应条件如下：95℃ 30 s，1 个循环;95℃ 5 s，60℃ 20 s，39 个循环。每个样品重复检测3次。利用2-△△Ct法计算miR-34a的相对表达量。
1.7 数据统计
所有数据均运用采用SPSS 17.0 for Windows统计软件对所获得的实验数据进行统计分析，所有数据以均数±标准差 （x[TX-*4]±s）表示。统计学方法采用单因素方差分析 （one-way analysis of variance， ANOVA）。显著性差异选择P<0.05和P<0.01水平。
2 研究结果与分析
2.1 间歇运动显著改善心梗大鼠心功能
心电图结果显示：间歇运动前假手术组大鼠心电图正常，P、Q、R、S、T 各波段规则;心梗手术后大鼠心电图出现S-T 段抬高或T 波倒置现象，由此断定MI 模型造模成功;间歇运动后ME 组大鼠心电图趋于正常，表明间歇运动对心梗大鼠是安全有效的，具有保护作用，且显著改善心功能（图1）。
2.2 间歇运动显著抑制心梗大鼠肾脏miR-34a的表达
RT-qPCR结果显示：与Sham組比较，MI组大鼠肾脏miR-34a表达显著增加 （P<0.01）;与MI组比较，ME组肾脏miR-34a表达显著减少 （P<0.01）。表明心梗大鼠肾脏组织miR-34a表达升高，间歇运动干预可明显抑制肾脏组织miR-34a表达（图2）。
2.3 间歇运动显著增加心梗大鼠肾脏SIRT1的表达
Western blot结果显示：与Sham组比较，MI组大鼠肾脏SIRT1表达显著减少 （P<0.01）;与MI组比较，ME组大鼠肾脏SIRT1表达显著增加 （P<0.01）（图3）。
2.4 间歇运动显著增加心梗大鼠血清及肾脏Trx-1的表达
ELISA结果显示：与Sham组比较，MI组大鼠肾脏Trx-1 mRNA表达增多，血清Trx-1水平升高 （均为P<0.01）;与MI组比较，ME组大鼠肾脏Trx-1 mRNA表达增多，血清Trx-1水平升高（均为P<0.01）。这表明心梗大鼠肾脏组织Trx-1应激性升高，间歇运动干预可显著促进肾脏组织Trx-1表达（图4）。
2.5 间歇运动显著抑制心梗大鼠肾脏NOX2和NOX4的表达
Western blot结果显示：与Sham组比较，MI组大鼠肾脏NOX2和NOX4表达显著增加（P<0.01）;与MI组比较，ME组大鼠肾脏NOX2和NOX4表达显著减少 （P<0.01） （图5）。
2.6 间歇运动显著增加心梗大鼠肾脏SOD1和SOD2的表达 Western blot结果显示：与Sham组比较，MI组大鼠肾脏SOD1和SOD2表达显著减少 （P<0.01）;与MI组比较，ME组大鼠肾脏SOD1和SOD2表达显著增加 （P<0.01）（图6）。
2.7 间歇运动显著增加心梗大鼠肾脏T-AOC和GSH-PX水平，抑制肾脏MDA和LDH的表达
结果显示：与Sham组比较，MI组大鼠肾组织匀浆中MDA含量和LDH活性显著升高（P<0.01），T-AOC总抗氧化能力和GSH-PX活性显著降低（P<0.01）;与MI组比较，ME组大鼠肾组织匀浆中MDA含量和LDH活性显著降低（P<0.01），T-AOC总抗氧化能力和GSH-PX活性显著升高（P<0.01） （表1）。
2.8 间歇运动显著抑制心梗大鼠血清及尿液NAG的表达
ELISA结果显示：与Sham组比较，MI组大鼠血清及尿液NAG表达显著升高（P<0.01）;与MI组比较，ME组大鼠血清及尿液NAG表达显著减少 （P<0.01）。这表明心梗受损导致肾功能紊乱，间歇运动干预可有效改善肾脏功能紊乱（图7）。
2.9 肾脏miR-34a表达与SIRT1、Trx-1、氧化应激变化的相关性
相关性分析结果显示，MI后血清 Trx-1与NAG表达呈显著正相关（r=0.98，P<0.01）。肾脏SIRT1蛋白表达与NOX2、NOX4、MDA和LDH表达呈显著负相关（r=-0.947，P<0.01;r=-0.931，P<0.01; r=-0.935，P<0.01;r=-0.856，P<0.01），与SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表达呈显著正相关（r =0.880，P<0.01; r=0.943，P<0.01; r =0.957，P<0.01; r=0.850，P<0.01）。表明，随着肾脏SIRT1表达的增加，MI大鼠肾脏氧化应激减少。 MI及MI间歇运动后，肾脏miR-34a表达与SIRT1表达呈显著负相关（r=-0.928，P<0.01），与MDA和LDH蛋白表达呈显著正相关（r=0.964，P<001;r=0.972，P<0.05），与SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表达呈显著负相关（r=-0.969，P<0.01;r=-0.937，P<0.01;r=-0.942，P<0.01;r=-0.830，P<001）。 表明，大鼠肾脏miR-34a表达与肾脏氧化应激密切关系。
3 讨论
研究发现，除心脏损伤外，MI靶向远隔器官损伤，包括大脑、肝脏和肾脏等[26]。先前的报道证实，MI后不久肾功能迅速下降[27]。心脏受损继发肾损害进展的发病机制很复杂，就病理而言，氧化应激是MI的主要原因之一。由MI引起靶器官损害的严重程度与这个变量直接相关。新近研究证实，心肌缺血和缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）显著增加血浆和肾脏MDA水平，下调肾脏SOD1、SOD2、GSH-Px和过氧化氢酶（catalase，CAT）基因表达，增加肾损伤标志物白细胞介素-18和肾损伤分子-1 （kidney injury molecule-1，KIM-1）的表达[28]。另研究证实，MI显著增加循环和肾脏MDA水平，降低SOD和T-AOC活性，减弱肾脏抗氧化能力，导致肾脏形态结构和功能受损[29]。本研究与上述研究相一致，结果显示，MI大鼠肾脏MDA含量和LDH活性显著升高， SOD1和SOD2蛋白表达下降，T-AOC和GSH-PX活性显著降低，肾损伤标志物NAG的血清和尿液水平显著升高。结果提示，MI后肾脏氧化应激水平升高，抗氧化能力降低，肾脏功能受损。在正常和病理情况下，NOX是肾脏氧化应激的主要来源[5]，而NOX4主要在啮齿动物的肾脏中表达[30]。体内外研究证实，AKI导致肾脏NOX4基因和蛋白表达增加，NOX4基因沉默可显著减轻AKI导致的肾脏细胞凋亡和炎症反应;利用NOX4基因沉默AKI小鼠进一步研究证实， NOX4沉默可恢复肾功能，减轻肾脏损害和减少炎症反应[31]。结果表明，干预NOX4异常表达或将成为防治肾脏损伤的新靶点或策略。另研究证实，MI后肾脏NOX2和NOX4表达显著增加，传统中草药复方心肌尔康显著降低MI大鼠肾脏循环和肾脏MDA水平，提高SOD和T-AOC活性，减少肾脏NOX4表达，提升肾脏形态结构和功能[29];卡格列净和恩格列净可显著降低糖尿病大鼠MI后肾脏NOX2和NOX4表达，降低肾损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关的脂蛋白和KIM-1表达，保护肾功能[32-33]。除药物外，有氧运动具有显著抗氧化应激能力[34]。有氧运动可显著抑制高盐膳食大鼠股动脉和延髓腹侧延髓中NADPH氧化酶亚基NOX4和NOX2的表达[35-36]，显著减少冠心病患者主动脉NOX2和NOX4基因和蛋白表达[37]。另研究证实，有氧运动显著降低卵巢切除大鼠肾脏脂质过氧化，上调肾脏CAT和SOD表达，改善肾脏氧化应激[38];显著减少MI大鼠肾脏MDA水平，提升肾功能[7];显著降低肾脏I/R大鼠肾脏MDA水平，升高GSH和CAT水平，减弱肾脏组织氧化应激[39]。本研究结果显示，MI大鼠肾脏NOX2和NOX4蛋白表达显著增加，间歇运动可显著减少MI大鼠肾脏NOX2和NOX4蛋白表达，降低MDA含量和LDH活性，增加抗氧化剂SOD1和SOD2蛋白表达，提升T-AOC和GSH-PX活性，降低血清和尿液NAG水平。结果表明，心肌缺血诱发肾脏氧化应激，间歇运动可有效抑制MI后肾脏氧化应激，改善肾功能。
研究证实，miRs参与肾脏氧化应激的调节。缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）诱导HK-2细胞中miR-423-5p表达增加，miR-423-5p过表达可显著增加活性氧水平，上调MDA和GST活性，下调SOD活性，促进细胞氧化应激;miR-423-5p 基因沉默可显著抑制H/R HK-2细胞氧化应激反应[40]。最新体内外研究发现， miR-27a-3p在肾脏I/R小鼠和H/R NRK-52E和HK-2细胞模型中表达上调，其过表达显著降低肾脏I/R小鼠肾脏SOD水平，增加血尿素氮、血肌酐和MDA水平，加剧I/R引起的肾脏损害，而抑制其表达可显著减轻肾脏I/R引起的氧化损伤[12]。另研究证实，miR-34a-5p上调表达在I/R大鼠心肌和I/R小鼠肠道中，加速活性氧积累，加剧心肌和肠氧化应激;抑制miR-34a-5p表达可抑制活性氧积累，减轻I/R导致的心肌和肠道损伤[41-42]。本研究结果显示，MI大鼠肾脏miR-34a表达显著增多，间歇运动显著减少MI大鼠肾脏miR-34a表達，且肾脏miR-34a表达与MDA和LDH蛋白表达呈显著正相关，与SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表达呈显著负相关。说明，间歇运动调节MI肾脏miR-34a表达，抑制肾脏氧化应激。业已证明，SIRT1在多种应激条件下的氧化损伤改善中起关键作用[43-44]。研究发现，糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）大鼠肾功能不全，SIRT1和SOD活性降低，肾组织MDA升高。SIRT1上调表达可逆转DN的生化、凋亡、氧化剂和病理学参数，上调SIRT1对DN具有保护作用，使肾脏细胞免受DN引起的进一步损害[45]。另研究证实，单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）小鼠肾脏氧化应激升高，SIRT1表达降低，而SIRT1激活可降低MDA水平，增加SOD、GPx和GSH水平，减弱肾脏氧化应激水平，表明SIRT1可能是纤维化肾病治疗的有效靶点[46]。本研究结果显示，MI大鼠肾脏SIRT1表达显著降低;间歇运动显著增加MI大鼠肾脏SIRT1表达，且肾脏SIRT1蛋白表达与MDA和LDH表达呈显著负相关，与SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表达呈显著正相关。提示，间歇运动调控MI大鼠肾脏SIRT1表达，调节肾脏氧化应激。研究证实，miR-34a靶向SIRT1参与氧化应激生理进程[47]。过氧化氢时间剂量依赖性上调支气管上皮细胞microRNA-34a表达，下调SIRT1基因和蛋白表达，且miR-34a过表达显著降低SIRT1的 mRNA和蛋白表达，miR-34a抑制剂增加了SIRT1 mRNA水平[48]。研究发现，顺铂诱导AKI大鼠和小鼠肾脏中miR-34a表达增加，SIRT1表达降低，MDA水平升高，SOD和GSH-PX表达降低;细胞实验进一步研究证实，miR-34a过表达显著降低顺铂诱导NRK-52E和HK-2细胞中SIRT1蛋白表达，增加氧化应激，提示miR-34a/SIRT1信号传导是控制肾脏氧化应激的重要途径[19]。本研究结果显示，MI大鼠肾脏miR-34a表达显著增多，SIRT1表达显著降低，MDA和LDH水平升高，SOD1、SOD2和GSH-PX表达降低。间歇运动显著减少MI大鼠肾脏miR-34a表达，增加SIRT1表达，降低MDA和LDH水平，升高SOD1、SOD2和GSH-PX水平，且肾脏miR-34a表达与SIRT蛋白表达呈显著负相关。说明，间歇运动可能通过miR-34a/SIRT1信号通路调控MI肾脏氧化应激。 Trx-1是在几乎所有真核细胞中表达丰富的125 kD胞质蛋白，在氧化还原信号中起重要作用。报道证实，循环Trx-1与全身氧化应激密切相关[49]，是可靠的氧化应激标志物。临床研究发现，慢性心衰患者血清Trx-1表达显著增加，肾小管损伤标志物NAG表达增加，且血浆Trx-1与肾损伤标志物NAG之间存在显著相关性，提示血浆Trx-1水平与肾小管损伤和心脏预后相关，可能是鉴别高合并性心力衰竭和肾小管损伤风险的有用标志物[50]。本研究发现，MI大鼠血清Trx-1水平显著升高，血清及尿液NAG水平增多，且两者存在显著相关性，与上述研究结果相一致。本研究进一步发现，MI大鼠肾脏Trx-1 mRNA表达同步增加，提示血清Trx-1可能是MI诱导肾脏损伤的生物标记物。实验研究表明，Trx-1抑制心脏和肾脏组织的氧化应激[51-52]。过表达Trx-1可显著减少MI小鼠心脏纤维化和氧化应激，减弱心肌细胞的凋亡，增加血管形成，改善心功能[51];Trx-1上调表达可显著减少糖尿病小鼠肾脏氧化应激指标8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）和丙烯醛加合物的表达，减缓肾小管损伤，表明Trx-1过表达会减轻肾脏氧化应激[52]。本研究结果显示，间歇运动可显著升高MI大鼠血清Trx-1水平，增加肾脏Trx-1 mRNA表达，降低肾脏氧化应激指标MDA和LDH的表达，提示，间歇运动上调Trx-1表达抑制MI肾脏氧化应激。另研究证实，心脏特异性过表达SIRT1可显著上调I/R小鼠心肌Trx-1和SOD2表达，下调8-OHdG表达，调控I/R后的氧化应激水平[53]。动物和细胞实验证实，SIRT1上调表达可显著增加UUO小鼠肾脏和衣霉素诱导HK-2细胞中Trx的表达[54]，新型黄嘌呤氧化酶抑制剂非布索坦上调SIRT1-Trx表达，抑制UUO小鼠肾脏和衣霉素诱导肾小管细胞的内质网应激[55]。Chen等研究发现，Trx1可显著降低ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞NADPH氧化酶活性，抑制NOX4和NOX2的表达，靶向降低NOX4-NOX2复合物水平，抑制细胞氧化应激[56]。表明，SIRT1-Trx介导的NOX4信号传导是调节氧化应激的重要途径。本研究结果显示，间歇运动大鼠SIRT1表达增多，肾脏 Trx-1 mRNA表达增加，肾脏NOX2和NOX4表达降低，且SIRT1表達与NOX2和NOX4表达呈显著负相关。提示，间歇运动可能激活心梗大鼠肾脏SIRT1-Trx-1介导的NOX4信号传导通路。推测，间歇运动抑制MI大鼠肾脏氧化应激，保护肾脏功能，其机制与miR-34a-SIRT1-Trx-1介导的NOX4信号传导通路激活密切相关。
4 结论
间歇运动可显著抑制心梗大鼠肾脏miR-34a表达，增加SIRT1和Trx-1，降低NOX2、NOX4、MDA和LDH的表达，增加SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px的表达，抑制肾脏氧化应激。推测，MI 肾脏功能改善和肾脏miR-34a表达降低及下游SIRT1-Trx-1介导的NOX4信号通路激活关系密切。表明，间歇运动可能通过激活肾脏miR-34a/SIRT1/Trx-1信号通路，抑制肾脏氧化应激，改善MI 大鼠肾脏功能。
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关键词：间歇运动; 心肌梗死; 氧化应激; miR-34a; SIRT1
中图分类号：G804.2 文献标识码：A 文章编号：1006-2076（2020）06-0044-10
Abstract： Objective：To determine the effects of aerobic interval training （AIT） on the expressions of microRNA-34a （miR-34a）， SIRT1 and Trx-1 and renal oxidative stress in rats with myocardial infarction （MI）. Methods：male Sprague Dawley rats were randomly divided into Sham-operated group （Sham）， Sedentary MI group （MI） and MI with AIT group （ME） （n=12）. The MI model was established by ligation the left anterior descending coronary artery（LAD）. Rats in ME were subjected to 8 weeks treadmill exercise training. （AIT：60 min/day with 10 min of warm-up at 10 m/min （40%～50%VO2 max） and 50 min of exercise at 25 m/min 7 min （85%～90% VO2 max） interspersed with 3 min at 15 m/min （ 50%～60% VO2 max））. After training renal function was evaluated. The levels of renal MDA content， T-AOC and GSH-Px activity by ultraviolet spectrophotometry. The activity of LDH in renal was determined by microplate assay. The levels of serumrx-1and serum， urine NAG were assessed by ELISA. The expression of renal miR-34a， Trx-1 was examined by RT-q PCR. The expression of renal SIRT1 protein was examined by western blotting. Results：Compared with the Sham group， MI increased the expression of renal MDA， LDH， NOX2， NOX4， Trx-1 mRNA and the level of serum Trx-1， serum and urine NAG， and the expression of renal miR-34a. Meanwhile， MI inhibited the expression of renal T-AOC， GSH-Px， SIRT1， SOD1 and SOD2. Compared with the MI group， AIT inhibited the expression of renal MDA， LDH， NOX2， NOX4， serum and urine NAG and the expression of renal miR-34a. Meanwhile， AIT up-regulated the expression of renal T-AOC， GSH-Px， SIRT1， SOD1， SOD2 and renal Trx-1 mRNA and the level of serum Trx-1. The serum level of Trx-1 was positively related to the level of NAG. The expression of SIRT1 protein was negatively related to the expression of NOX2， NOX4， MDA and LDH， and positively related to the xpression of SOD1， SOD2， T-AOC and GSH-Px. The expression of miR-34a was negatively related to the expression of SIRT1， SOD1， SOD2， T-AOC and GSH-Px protein， and positively related to the expression of MDA and LDH. Conclusion：AIT inhibits the level of renal miR-34a， activates the downstream SIRT1/Trx-1 regulated NOX4 signaling pathway. It shows that the miR-34a/ SIRT1/Trx-1 signaling pathway plays an important role in the inhibition of AIT on oxidative stress in the kidneys of rats with myocardial infarction. Key words： aerobic interval training; myocardial infarction; oxidative stress; miR-34a; SIRT1
众所周知，心肌梗死（myocardial infarction，MI）心输出量减少，肾脏血流连续减少，诱发肾脏氧化应激和炎症反应[1～2]，导致急性肾脏损伤（acute kidney injury，AKI），继发肾功能紊乱。研究证实，氧化应激是AKI的主要决定因素，氧化应激水平升高与NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX） 活化有关，其是生成活性氧的主要酶体[3]。NADPH氧化酶家族有7种亚型，分别是NOX1-5以及2种双氧化酶DUOX-1和DUOX-2，其中NOX4是肾脏中的主要形式，NOX2也同时表达[4]。研究发现，NOXs上调表达在肾脏氧化应激和肾脏损伤中发挥重要作用[5]，肾脏缺血缺氧诱发NOX2和NOX4表达增加，氧化应激增强，细胞凋亡增多，而抑制NOX4表达可显著减少肾脏缺血导致的氧化应激和细胞凋亡，减缓肾脏损伤[6]。 提示，NOX4是肾脏氧化应激损伤进程的重要靶点。大量研究证实，有氧运动增强抗氧化能力并减弱正常及疾病大鼠肾脏氧化应激[7-8]。有氧运动可显著减少MI大鼠肾脏脂质过氧化，增强肾脏抗氧化能力[7]，减轻高盐饮食引起的肾脏氧化应激[8]。另有研究证实，间歇运动较有氧运动更有效保护肾脏功能[9-10]。但间歇运动是否抑制MI大鼠肾脏NOX4表达，抑制肾脏氧化应激，目前尚无文献报道。
研究证实，多种生物分子和信号通路影响氧化应激。microRNAs（miRs）通过抑制mRNA转录或促进mRNA降解，成为许多生物进程的调节者[11]，其作为信号分子参与肾脏损伤发生机制与病理生理过程。体内外研究证实，肾脏损伤后miR-27a-3p和miR-320等表达水平与肾脏氧化应激水平同步上调，抑制其表达可显著减轻肾脏氧化应激反应，减少肾脏损伤[12-13]。提示，miRs可作为肾脏疾病的生物标记物和/或潜在治疗靶点。miR-34家族成员miR-34a在氧化应激[14]、炎症[15]和细胞凋亡[16]中起重要作用，且证实直接靶向NAD +依赖性核III类组蛋白去乙酰化酶sirtuin 1（SIRT1）[17]。已知SIRT1通过去乙酰化或与几种靶蛋白相互作用来抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡而发挥肾脏保护作用[18]。体内外实验研究证实，肾毒性大鼠、小鼠及肾脏细胞中miR-34a表达增加，SIRT1表达降低，氧化应激水平升高[19]。另研究证实，硫氧还蛋白-1 （Thioredoxin-1， Trx-1），一种具有氧化还原/炎症调节特性且普遍存在的硫醇蛋白，通过抑制氧化应激保护代谢综合征心血管功能[20]和横纹肌溶解相关急性肾损伤的肾脏功能[21]。研究发现，SIRT1上调表达显著增加衣霉素诱导近端肾小管细胞和内质网应激小鼠肾小管中Trx的表达，抑制肾脏氧化应激[22]。表明，miR-34a/ SIRT1介导的Trx-1信号传导是控制肾脏氧化应激的重要途径。研究证实，运动通过调控miRs表达参与肾脏生理病理进程[23-24]。但运动是否激活MI肾脏miR-34a/SIRT1/Trx-1信号通路，抑制氧化应激反应，保护肾脏功能，目前尚无文献报道。因此，本研究拟探讨间歇运动对MI大鼠肾脏miR-34a和氧化应激的影响及其可能機制，为运动改善MI的病理进程及其机制探讨和相关治疗靶点筛选提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
主要试剂：TRIzol（购于Inventragtion）、反转录试剂盒（购于TAKARA）、兔抗多克隆抗体SIRT1（购于Bioworld）、兔抗单克隆抗体超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 1、SOD2、NOX2和NOX4（购于Abcam）、PCR引物（购于上海生工）、ELISA试剂盒（购于美国R&D公司）、氧化应激试剂盒丙二醛（malondialdehyde，MDA）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）（购于南京建成生物科技有限公司）等。
主要仪器： PowerLab 8/30生理信号采集系统、Bio-Rad电泳仪和转移槽、Bio-Rad凝胶成像系统、BX51奥林巴斯光学显微镜、Thermo低温高速离心机、尼康荧光显微镜、Bio-Rad PCR扩增仪等。
1.2 动物分组与MI模型制备
动物分组：3月龄雄性SD大鼠36只 （购自西安交通大学医学院实验动物中心，动物质量合格证号：陕医动证字SCXK2012-098），体重180～220 g，国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，自由饮食。动物室内温度为20℃～29℃，湿度为50%～60%。动物随机分为假手术组 （Sham组）、心肌梗死组 （MI组）和心梗+间歇有氧运动组 （ME组），每组12只。Sham组大鼠常规笼内安静饲养，MI 组采用左冠状动脉前降支 （ LAD） 结扎法，制备MI 模型。ME 组进行为期4周的小动物跑台运动。
MI模型制备：5%戊巴比妥钠腹腔麻醉，采用大鼠呼吸面罩进行呼吸机辅助呼吸 （60次/min，潮气量16 mL，呼吸比1∶2），多道生理信号采集处理系统记录大鼠肢导心电图 （ECG）。开胸暴露心脏，于左心耳根部和肺动脉圆锥左缘交界下2 mm 处用5/0手术线结扎左冠状动脉前降支（LAD），结扎后肉眼可见结扎远端心肌颜色逐渐变浅或变白，主要局限在LV，靠近心尖部最为明显。利用心电图监测评价MI模型，大鼠MI 后心电图出现S-T段抬高或T波倒置现象。由此断定MI模型造模成功。然后逐层缝合关胸。为了排除手术因素干扰，Sham组大鼠手术过程同上，但仅穿线而不结扎LAD。ME组大鼠在MI模型成功后1 周开始训练。 1.3 间歇有氧运动方案
运动方案参考Wisloff训练模型[25]。ME组大鼠术后1周进行跑台运动。适应性训练1周 （10～15 m/min，30 min/d，共5 d）。正式训练起始速度10 min×10 m/min （40%～50%VO2max） 热身，以7 min×25 m/min（85%～90% VO2max） 和3 min×15 m/min（50%～60%VO2 max）交替进行大中等强度间歇运动。总时间为60 min，每周训练5 d，连续训练4 w。上述运动方案无大鼠死亡。
1.4 样本处理及生化指标测定
4周运动结束后次日，测定心电图，腹主动脉取血及膀胱取尿后，迅速摘取肾脏，液氮骤冷，转移至-80℃超低温冰箱保存备用。
血液及尿液样本离心后弃沉淀留取上清液，严格参照试剂盒说明对肾脏MDA、LDH、T-AOC、GSH-Px进行测定;运用ELISA法，严格按照试剂盒（R&D公司）操作步骤对血清Trx-1及血清和尿液中N-乙酸-β-D-葡萄糖苷酶（N-acetyl-beta-D-glucosaminidase， NAG）的含量进行测定。
1.5 Western Blot
采用RIPA提取肾脏总蛋白质，Bradford法测定蛋白浓度。10～12% SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离后，转至PVDF膜，3% BSA室温摇床封闭1 h后，分别加入兔抗多克隆抗体SIRT1 （1∶400）、兔抗单克隆抗体SOD1（1∶50 000）、SOD2（1∶5000）、NOX2（1∶5000）、NOX4（1∶5000），4℃过夜，室温复温30 min后，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗抗体 （1∶10 000） 孵育1 h，TBST清洗，ECL发光。内参为GAPDH （1∶8000）。
1.6 RT-qPCR
用TRIzol试剂提取肾脏总RNA，严格按照反转录试剂盒说明书操作步骤反转录合成cDNA，后进行RT-qPCR反应，内参为GAPDH。引物序列如下：Trx-1上游引物：5′-CTG ATCGAGAGCAAGGAAGC-3′，下游引物：5′-TCA AGGAACACCACATTGGA-3′，扩增产物长度为158 bp;GAPDH 上游引物：5′-ACAGCAA CAGGGT GGT GGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，扩增产物为252 bp。反应条件如下：95℃ 10 min，1 循环;95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 循环;72℃ 10 min。每个样品重复检测3次。利用2-△△Ct法计算相对基因表达量。
用TRIzol试剂提取肾脏总RNA，按microRNA反转录试剂盒说明书方法反转录合成cDNA，再以此cDNA为模板按PCR试剂盒进行PCR反应。引物和探针由宝生物工程有限公司（TaKaRa）设计和合成，U6为内参。反应条件如下：95℃ 30 s，1 个循环;95℃ 5 s，60℃ 20 s，39 个循环。每个样品重复检测3次。利用2-△△Ct法计算miR-34a的相对表达量。
1.7 数据统计
所有数据均运用采用SPSS 17.0 for Windows统计软件对所获得的实验数据进行统计分析，所有数据以均数±标准差 （x[TX-*4]±s）表示。统计学方法采用单因素方差分析 （one-way analysis of variance， ANOVA）。显著性差异选择P<0.05和P<0.01水平。
2 研究结果与分析
2.1 间歇运动显著改善心梗大鼠心功能
心电图结果显示：间歇运动前假手术组大鼠心电图正常，P、Q、R、S、T 各波段规则;心梗手术后大鼠心电图出现S-T 段抬高或T 波倒置现象，由此断定MI 模型造模成功;间歇运动后ME 组大鼠心电图趋于正常，表明间歇运动对心梗大鼠是安全有效的，具有保护作用，且显著改善心功能（图1）。
2.2 间歇运动显著抑制心梗大鼠肾脏miR-34a的表达
RT-qPCR结果显示：与Sham組比较，MI组大鼠肾脏miR-34a表达显著增加 （P<0.01）;与MI组比较，ME组肾脏miR-34a表达显著减少 （P<0.01）。表明心梗大鼠肾脏组织miR-34a表达升高，间歇运动干预可明显抑制肾脏组织miR-34a表达（图2）。
2.3 间歇运动显著增加心梗大鼠肾脏SIRT1的表达
Western blot结果显示：与Sham组比较，MI组大鼠肾脏SIRT1表达显著减少 （P<0.01）;与MI组比较，ME组大鼠肾脏SIRT1表达显著增加 （P<0.01）（图3）。
2.4 间歇运动显著增加心梗大鼠血清及肾脏Trx-1的表达
ELISA结果显示：与Sham组比较，MI组大鼠肾脏Trx-1 mRNA表达增多，血清Trx-1水平升高 （均为P<0.01）;与MI组比较，ME组大鼠肾脏Trx-1 mRNA表达增多，血清Trx-1水平升高（均为P<0.01）。这表明心梗大鼠肾脏组织Trx-1应激性升高，间歇运动干预可显著促进肾脏组织Trx-1表达（图4）。
2.5 间歇运动显著抑制心梗大鼠肾脏NOX2和NOX4的表达
Western blot结果显示：与Sham组比较，MI组大鼠肾脏NOX2和NOX4表达显著增加（P<0.01）;与MI组比较，ME组大鼠肾脏NOX2和NOX4表达显著减少 （P<0.01） （图5）。
2.6 间歇运动显著增加心梗大鼠肾脏SOD1和SOD2的表达 Western blot结果显示：与Sham组比较，MI组大鼠肾脏SOD1和SOD2表达显著减少 （P<0.01）;与MI组比较，ME组大鼠肾脏SOD1和SOD2表达显著增加 （P<0.01）（图6）。
2.7 间歇运动显著增加心梗大鼠肾脏T-AOC和GSH-PX水平，抑制肾脏MDA和LDH的表达
结果显示：与Sham组比较，MI组大鼠肾组织匀浆中MDA含量和LDH活性显著升高（P<0.01），T-AOC总抗氧化能力和GSH-PX活性显著降低（P<0.01）;与MI组比较，ME组大鼠肾组织匀浆中MDA含量和LDH活性显著降低（P<0.01），T-AOC总抗氧化能力和GSH-PX活性显著升高（P<0.01） （表1）。
2.8 间歇运动显著抑制心梗大鼠血清及尿液NAG的表达
ELISA结果显示：与Sham组比较，MI组大鼠血清及尿液NAG表达显著升高（P<0.01）;与MI组比较，ME组大鼠血清及尿液NAG表达显著减少 （P<0.01）。这表明心梗受损导致肾功能紊乱，间歇运动干预可有效改善肾脏功能紊乱（图7）。
2.9 肾脏miR-34a表达与SIRT1、Trx-1、氧化应激变化的相关性
相关性分析结果显示，MI后血清 Trx-1与NAG表达呈显著正相关（r=0.98，P<0.01）。肾脏SIRT1蛋白表达与NOX2、NOX4、MDA和LDH表达呈显著负相关（r=-0.947，P<0.01;r=-0.931，P<0.01; r=-0.935，P<0.01;r=-0.856，P<0.01），与SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表达呈显著正相关（r =0.880，P<0.01; r=0.943，P<0.01; r =0.957，P<0.01; r=0.850，P<0.01）。表明，随着肾脏SIRT1表达的增加，MI大鼠肾脏氧化应激减少。 MI及MI间歇运动后，肾脏miR-34a表达与SIRT1表达呈显著负相关（r=-0.928，P<0.01），与MDA和LDH蛋白表达呈显著正相关（r=0.964，P<001;r=0.972，P<0.05），与SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表达呈显著负相关（r=-0.969，P<0.01;r=-0.937，P<0.01;r=-0.942，P<0.01;r=-0.830，P<001）。 表明，大鼠肾脏miR-34a表达与肾脏氧化应激密切关系。
3 讨论
研究发现，除心脏损伤外，MI靶向远隔器官损伤，包括大脑、肝脏和肾脏等[26]。先前的报道证实，MI后不久肾功能迅速下降[27]。心脏受损继发肾损害进展的发病机制很复杂，就病理而言，氧化应激是MI的主要原因之一。由MI引起靶器官损害的严重程度与这个变量直接相关。新近研究证实，心肌缺血和缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）显著增加血浆和肾脏MDA水平，下调肾脏SOD1、SOD2、GSH-Px和过氧化氢酶（catalase，CAT）基因表达，增加肾损伤标志物白细胞介素-18和肾损伤分子-1 （kidney injury molecule-1，KIM-1）的表达[28]。另研究证实，MI显著增加循环和肾脏MDA水平，降低SOD和T-AOC活性，减弱肾脏抗氧化能力，导致肾脏形态结构和功能受损[29]。本研究与上述研究相一致，结果显示，MI大鼠肾脏MDA含量和LDH活性显著升高， SOD1和SOD2蛋白表达下降，T-AOC和GSH-PX活性显著降低，肾损伤标志物NAG的血清和尿液水平显著升高。结果提示，MI后肾脏氧化应激水平升高，抗氧化能力降低，肾脏功能受损。在正常和病理情况下，NOX是肾脏氧化应激的主要来源[5]，而NOX4主要在啮齿动物的肾脏中表达[30]。体内外研究证实，AKI导致肾脏NOX4基因和蛋白表达增加，NOX4基因沉默可显著减轻AKI导致的肾脏细胞凋亡和炎症反应;利用NOX4基因沉默AKI小鼠进一步研究证实， NOX4沉默可恢复肾功能，减轻肾脏损害和减少炎症反应[31]。结果表明，干预NOX4异常表达或将成为防治肾脏损伤的新靶点或策略。另研究证实，MI后肾脏NOX2和NOX4表达显著增加，传统中草药复方心肌尔康显著降低MI大鼠肾脏循环和肾脏MDA水平，提高SOD和T-AOC活性，减少肾脏NOX4表达，提升肾脏形态结构和功能[29];卡格列净和恩格列净可显著降低糖尿病大鼠MI后肾脏NOX2和NOX4表达，降低肾损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关的脂蛋白和KIM-1表达，保护肾功能[32-33]。除药物外，有氧运动具有显著抗氧化应激能力[34]。有氧运动可显著抑制高盐膳食大鼠股动脉和延髓腹侧延髓中NADPH氧化酶亚基NOX4和NOX2的表达[35-36]，显著减少冠心病患者主动脉NOX2和NOX4基因和蛋白表达[37]。另研究证实，有氧运动显著降低卵巢切除大鼠肾脏脂质过氧化，上调肾脏CAT和SOD表达，改善肾脏氧化应激[38];显著减少MI大鼠肾脏MDA水平，提升肾功能[7];显著降低肾脏I/R大鼠肾脏MDA水平，升高GSH和CAT水平，减弱肾脏组织氧化应激[39]。本研究结果显示，MI大鼠肾脏NOX2和NOX4蛋白表达显著增加，间歇运动可显著减少MI大鼠肾脏NOX2和NOX4蛋白表达，降低MDA含量和LDH活性，增加抗氧化剂SOD1和SOD2蛋白表达，提升T-AOC和GSH-PX活性，降低血清和尿液NAG水平。结果表明，心肌缺血诱发肾脏氧化应激，间歇运动可有效抑制MI后肾脏氧化应激，改善肾功能。
研究证实，miRs参与肾脏氧化应激的调节。缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）诱导HK-2细胞中miR-423-5p表达增加，miR-423-5p过表达可显著增加活性氧水平，上调MDA和GST活性，下调SOD活性，促进细胞氧化应激;miR-423-5p 基因沉默可显著抑制H/R HK-2细胞氧化应激反应[40]。最新体内外研究发现， miR-27a-3p在肾脏I/R小鼠和H/R NRK-52E和HK-2细胞模型中表达上调，其过表达显著降低肾脏I/R小鼠肾脏SOD水平，增加血尿素氮、血肌酐和MDA水平，加剧I/R引起的肾脏损害，而抑制其表达可显著减轻肾脏I/R引起的氧化损伤[12]。另研究证实，miR-34a-5p上调表达在I/R大鼠心肌和I/R小鼠肠道中，加速活性氧积累，加剧心肌和肠氧化应激;抑制miR-34a-5p表达可抑制活性氧积累，减轻I/R导致的心肌和肠道损伤[41-42]。本研究结果显示，MI大鼠肾脏miR-34a表达显著增多，间歇运动显著减少MI大鼠肾脏miR-34a表達，且肾脏miR-34a表达与MDA和LDH蛋白表达呈显著正相关，与SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表达呈显著负相关。说明，间歇运动调节MI肾脏miR-34a表达，抑制肾脏氧化应激。业已证明，SIRT1在多种应激条件下的氧化损伤改善中起关键作用[43-44]。研究发现，糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）大鼠肾功能不全，SIRT1和SOD活性降低，肾组织MDA升高。SIRT1上调表达可逆转DN的生化、凋亡、氧化剂和病理学参数，上调SIRT1对DN具有保护作用，使肾脏细胞免受DN引起的进一步损害[45]。另研究证实，单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）小鼠肾脏氧化应激升高，SIRT1表达降低，而SIRT1激活可降低MDA水平，增加SOD、GPx和GSH水平，减弱肾脏氧化应激水平，表明SIRT1可能是纤维化肾病治疗的有效靶点[46]。本研究结果显示，MI大鼠肾脏SIRT1表达显著降低;间歇运动显著增加MI大鼠肾脏SIRT1表达，且肾脏SIRT1蛋白表达与MDA和LDH表达呈显著负相关，与SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px表达呈显著正相关。提示，间歇运动调控MI大鼠肾脏SIRT1表达，调节肾脏氧化应激。研究证实，miR-34a靶向SIRT1参与氧化应激生理进程[47]。过氧化氢时间剂量依赖性上调支气管上皮细胞microRNA-34a表达，下调SIRT1基因和蛋白表达，且miR-34a过表达显著降低SIRT1的 mRNA和蛋白表达，miR-34a抑制剂增加了SIRT1 mRNA水平[48]。研究发现，顺铂诱导AKI大鼠和小鼠肾脏中miR-34a表达增加，SIRT1表达降低，MDA水平升高，SOD和GSH-PX表达降低;细胞实验进一步研究证实，miR-34a过表达显著降低顺铂诱导NRK-52E和HK-2细胞中SIRT1蛋白表达，增加氧化应激，提示miR-34a/SIRT1信号传导是控制肾脏氧化应激的重要途径[19]。本研究结果显示，MI大鼠肾脏miR-34a表达显著增多，SIRT1表达显著降低，MDA和LDH水平升高，SOD1、SOD2和GSH-PX表达降低。间歇运动显著减少MI大鼠肾脏miR-34a表达，增加SIRT1表达，降低MDA和LDH水平，升高SOD1、SOD2和GSH-PX水平，且肾脏miR-34a表达与SIRT蛋白表达呈显著负相关。说明，间歇运动可能通过miR-34a/SIRT1信号通路调控MI肾脏氧化应激。 Trx-1是在几乎所有真核细胞中表达丰富的125 kD胞质蛋白，在氧化还原信号中起重要作用。报道证实，循环Trx-1与全身氧化应激密切相关[49]，是可靠的氧化应激标志物。临床研究发现，慢性心衰患者血清Trx-1表达显著增加，肾小管损伤标志物NAG表达增加，且血浆Trx-1与肾损伤标志物NAG之间存在显著相关性，提示血浆Trx-1水平与肾小管损伤和心脏预后相关，可能是鉴别高合并性心力衰竭和肾小管损伤风险的有用标志物[50]。本研究发现，MI大鼠血清Trx-1水平显著升高，血清及尿液NAG水平增多，且两者存在显著相关性，与上述研究结果相一致。本研究进一步发现，MI大鼠肾脏Trx-1 mRNA表达同步增加，提示血清Trx-1可能是MI诱导肾脏损伤的生物标记物。实验研究表明，Trx-1抑制心脏和肾脏组织的氧化应激[51-52]。过表达Trx-1可显著减少MI小鼠心脏纤维化和氧化应激，减弱心肌细胞的凋亡，增加血管形成，改善心功能[51];Trx-1上调表达可显著减少糖尿病小鼠肾脏氧化应激指标8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）和丙烯醛加合物的表达，减缓肾小管损伤，表明Trx-1过表达会减轻肾脏氧化应激[52]。本研究结果显示，间歇运动可显著升高MI大鼠血清Trx-1水平，增加肾脏Trx-1 mRNA表达，降低肾脏氧化应激指标MDA和LDH的表达，提示，间歇运动上调Trx-1表达抑制MI肾脏氧化应激。另研究证实，心脏特异性过表达SIRT1可显著上调I/R小鼠心肌Trx-1和SOD2表达，下调8-OHdG表达，调控I/R后的氧化应激水平[53]。动物和细胞实验证实，SIRT1上调表达可显著增加UUO小鼠肾脏和衣霉素诱导HK-2细胞中Trx的表达[54]，新型黄嘌呤氧化酶抑制剂非布索坦上调SIRT1-Trx表达，抑制UUO小鼠肾脏和衣霉素诱导肾小管细胞的内质网应激[55]。Chen等研究发现，Trx1可显著降低ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞NADPH氧化酶活性，抑制NOX4和NOX2的表达，靶向降低NOX4-NOX2复合物水平，抑制细胞氧化应激[56]。表明，SIRT1-Trx介导的NOX4信号传导是调节氧化应激的重要途径。本研究结果显示，间歇运动大鼠SIRT1表达增多，肾脏 Trx-1 mRNA表达增加，肾脏NOX2和NOX4表达降低，且SIRT1表達与NOX2和NOX4表达呈显著负相关。提示，间歇运动可能激活心梗大鼠肾脏SIRT1-Trx-1介导的NOX4信号传导通路。推测，间歇运动抑制MI大鼠肾脏氧化应激，保护肾脏功能，其机制与miR-34a-SIRT1-Trx-1介导的NOX4信号传导通路激活密切相关。
4 结论
间歇运动可显著抑制心梗大鼠肾脏miR-34a表达，增加SIRT1和Trx-1，降低NOX2、NOX4、MDA和LDH的表达，增加SOD1、SOD2、T-AOC和GSH-Px的表达，抑制肾脏氧化应激。推测，MI 肾脏功能改善和肾脏miR-34a表达降低及下游SIRT1-Trx-1介导的NOX4信号通路激活关系密切。表明，间歇运动可能通过激活肾脏miR-34a/SIRT1/Trx-1信号通路，抑制肾脏氧化应激，改善MI 大鼠肾脏功能。
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