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摘要：目的 以雷公藤内酯酮为指标，考察黄芪配伍雷公藤前后的雷公藤毒性成分的含量变化，以期推断其可能配伍减毒机制。方法 采用高效液相色谱法比较分析黄芪配伍雷公藤前后毒性成分雷公藤内酯酮含量变化，从化学成分层次分析其减毒的物质基础变化，并结合中药七情中“相畏相杀”理论，推断其可能配伍减毒机制。结果 含量测定试验中黄芪配伍雷公藤的雷公藤内酯酮平均含量（0.42×10-3 mg/mL）明显低于单味雷公藤的雷公藤内酯酮含量（0.54×10-3 mg/mL），说明黄芪配伍雷公藤后降低了雷公藤内酯酮的含量。结论 黄芪与雷公藤配伍可降低雷公藤毒性。
关键词：雷公藤内酯酮；黄芪；高效液相色谱法；相畏相杀
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.023
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0087-04
雷公藤Triptergium wilfordii Hook. f.系卫矛科Celastraceae雷公藤属木质藤本植物，味辛、苦，性寒，归肝、肾经，常作为临床上治疗风湿顽痹之要药。现代药理及临床研究发现，雷公藤具有抗炎、免疫调节等多种生物活性[1-5]，特别是近几年研究发现其具有
抗HIV病毒作用和对阿尔茨海默病的治疗作用[6]，引起药理、毒理及临床学者的关注。但因其有大毒，尤其主要活性成分二萜类（如雷公藤甲素、雷公藤内酯酮）的毒性较强，在很大程度上限制了雷公藤在临床上的应用[7-8]。有学者基于文本挖掘技术探讨雷公藤用药规律，发现雷公藤与黄芪配伍在临床应用中频率最高[9]。本课题组前期毒理学研究显示，雷公藤与黄芪配伍较单味雷公藤毒性明显降低[10]。本研究以雷公藤内酯酮为指标，考察黄芪配伍雷公藤前后的雷公藤毒性成分的含量变化，以期推断其可能的配伍减毒机制[11-12]。
1 仪器与试药
安捷伦1260液相色谱仪（美国Agilent公司），Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），BP211D电子天平（德国赛多利斯），HDM-1000数显控温电热套（江苏省金华市荣坛仪器制造有限公司），HH-4数显恒温水浴锅（江苏省金华市荣坛仪器制造有限公司），HH-S数显恒温水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂），RE-85Z旋转蒸发仪（巩义市英峪予华仪器厂），KQ-3200 DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），DZF-6020真空干燥箱（巩义市英峪予华仪器厂），SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），101A-S1型数显电热鼓风干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司），DF-10A摇摆式中药粉碎机（温岭市奥力中药机械有限公司）。
黄芪，合肥天星乐家老铺中药饮片有限公司，批号12072102；雷公藤，合肥天星乐家老铺中药饮片有限公司，批号12072102。所用药材均经安徽中医药大学第一附属医院李立华教授鉴定符合现行药典规定。雷公藤内酯酮对照品，北京盛世康普化工技术研究院，纯度≥98%，批号20130826；甲醇为色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，批号20130918；水为屈臣氏蒸馏水，其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：welch material Inc C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相：甲醇-水溶液（55∶45）；流速：1.0 mL/min；检测波长：218 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 ?L。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取雷公藤内酯酮对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.021 5 mg/mL的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 雷公藤药材干燥后打成细粉，过40目筛，取药材粉末10 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加75%乙醇回流提取2次，第1次加10倍量乙醇、回流2.0 h，第2次加8倍量乙醇、回流1.5 h，合并醇提液，过滤，回收乙醇。药渣加8倍量水煎煮提取1.5 h，过滤，吸取上清液，同醇提液合并减压浓缩收膏，真空干燥，得干浸膏。将所得的干浸膏置索氏提取器中，加150 mL乙酸乙酯-甲醇（15∶1）于提取器中，于约97 ℃水浴中回流4 h，将回流液挥干部分溶剂，浓缩至约20 mL左右时转移至已用30 mL乙酸乙酯预洗的中性氧化铝（100～200目）的层析柱中，再以80 mL乙酸乙酯洗脱，收集流出液和洗脱液，于水浴锅中蒸除乙酸乙酯，残渣用甲醇超声5 min以上使充分溶解，定容于5 mL容量瓶中，过0.45 ?m微孔滤膜，作为雷公藤供试品溶液。取雷公藤药材10 g、黄芪20 g（均过40目筛），其余供试品溶液提取步骤同上，定容于5 mL容量瓶中，过0.45 ?m微孔滤膜，作为雷黄组供试品溶液。
2.3 专属性试验
按“2.1”项下色谱条件，吸取对照品溶液、雷公藤供试品溶液、雷黄组供试品溶液各10 ?L，分别注入色谱仪，进行测定。对照品及样品色谱图见图1。从色谱图中可以看出，两供试品色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，在相同保留时间有对应的色谱峰。在此色谱条件下，雷公藤内酯酮达到基线分离，样品中其他成分对雷公藤内酯酮的测试无干扰。
2.4 线性关系考察
精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 ?L、按“2.1”项下色谱条件进样测定，以进样量（?g）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=1958.5X-2.446 7（r=0.999 9），结果表明雷公藤内酯酮进样量在0.043～0.258 ?g范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。 2.5 精密度试验
精密吸取上述对照品溶液各10.0 ?L，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD，结果峰面积RSD=1.00%，表明仪器精密度较好，符合要求。
2.6 稳定性试验
精密吸取按“2.2.2”项下方法制备的雷公藤供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定并记录峰面积，计算RSD。结果峰面积RSD=1.38%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好，符合要求。
2.7 重复性试验
取同一批号的雷公藤药材6份，约10 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法分别制成雷公藤供试品溶液，精密吸取10 ?L，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积。结果雷公藤中雷公藤内酯酮含量RSD=1.58%，表明本试验重复性较好，符合要求。
2.8 加样回收率试验
取已知含量同一产地、同一批号的雷公藤药材，共6份，约10 g，精密称定，按照试验要求，分别加入一定体积的配制好浓度的雷公藤内酯酮对照品溶液（0.20 mg/mL），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，过0.22 ?m微孔滤膜，按上述色谱条件进行测定，结果见表1。
2.9 供试品含量测定
取3份10 g雷公藤、3份10 g雷公藤和20 g黄芪，分别按供试品溶液制备方法制备3份雷公藤供试品溶液和3份雷黄组供试品溶液，按照上述色谱条件进样，计算雷公藤内酯酮含量，结果见表2。可知，雷黄组中的雷公藤内酯酮含量低于雷公藤中的雷公藤内酯酮含量，说明黄芪配伍雷公藤后降低了雷公藤内酯酮的含量。
3 讨论
配伍是中医方剂学的核心内容，药物七情理论是中药配伍理论的核心部分。《神农本草经·序录》云：“若有毒宜制，可用相畏相杀者。”“相畏相杀”通过抑制或消除毒副作用达到全面兼顾、拮抗或消除毒性。临床以黄芪配伍雷公藤，使其共同形成一种相互对立、相互依存、缺一不可的相畏相杀关系，达到相制相成、存利除弊、调偏、制毒的目的。辛苦之药雷公藤，引燥为胜；黄芪性甘、微温，补气升阳、益卫固表。刚燥大毒雷公藤配伍甘温柔润黄芪，以甘温柔润制其刚燥大毒，温煦与司腠理开阖[13-14]。
雷公藤内酯酮是雷公藤中的环氧二萜内酯类化合物，此类结构对高温、酸碱较敏感，故在热水碱中内酯结构容易开环。黄芪的主要有效成分是黄芪苷，实验测得其提取液呈弱碱性，以黄芪配伍雷公藤后，黄芪苷的弱碱性使雷公藤内酯酮开环，从而降低了指标成分的含量。故笔者推断以上就是黄芪配伍雷公藤降低雷公藤毒性的可能作用机制。本课题组后期将进行毒理实验研究，进一步验证雷公藤内酯酮含量的变化与配伍减毒的相关性，揭示中药配伍的可能作用机制。
参考文献：
[1] 郑家润，顾克显，徐兰芳，等.雷公藤抗炎免疫及抗生育活性成份的筛选——Ⅲ.7个环氧二萜内酯化合物体内抗炎免疫活性的比较[J].中国医学科学院学报，1991，13（6）：391-397.
[2] 王岚，叶惟三，惠玲，等.雷公藤内酯酮的雄性抗生育作用及其作用机制[J].中国医学科学院学报，2000，22（3）：223.
[3] 黄之镨，陈普，马伟光.雷公藤的毒性作用及减毒研究进展[J].中国民间民族医药，2013，22（12）：20-21.
[4] 李春庆，孙伟，邵家德.雷公藤减毒研究评述[J].中国实验方剂学杂志， 2011，17（10）：263-265.
[5] 周学平，周玲玲，王旭.基于“异类相制”理论探讨中药复方的配伍减毒[J].中医杂志，2013，54（4）：271-273.
[6] 徐晖，黄颖.中药治疗类风湿关节炎的研究进展[J].云南中医中药杂志，2015，36（1）：88-90.
[7] 石卫东.论扶正祛邪法则的临床意义[J].光明中医，2011，26（3）：421- 423
关键词：雷公藤内酯酮；黄芪；高效液相色谱法；相畏相杀
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.023
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0087-04
雷公藤Triptergium wilfordii Hook. f.系卫矛科Celastraceae雷公藤属木质藤本植物，味辛、苦，性寒，归肝、肾经，常作为临床上治疗风湿顽痹之要药。现代药理及临床研究发现，雷公藤具有抗炎、免疫调节等多种生物活性[1-5]，特别是近几年研究发现其具有
抗HIV病毒作用和对阿尔茨海默病的治疗作用[6]，引起药理、毒理及临床学者的关注。但因其有大毒，尤其主要活性成分二萜类（如雷公藤甲素、雷公藤内酯酮）的毒性较强，在很大程度上限制了雷公藤在临床上的应用[7-8]。有学者基于文本挖掘技术探讨雷公藤用药规律，发现雷公藤与黄芪配伍在临床应用中频率最高[9]。本课题组前期毒理学研究显示，雷公藤与黄芪配伍较单味雷公藤毒性明显降低[10]。本研究以雷公藤内酯酮为指标，考察黄芪配伍雷公藤前后的雷公藤毒性成分的含量变化，以期推断其可能的配伍减毒机制[11-12]。
1 仪器与试药
安捷伦1260液相色谱仪（美国Agilent公司），Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），BP211D电子天平（德国赛多利斯），HDM-1000数显控温电热套（江苏省金华市荣坛仪器制造有限公司），HH-4数显恒温水浴锅（江苏省金华市荣坛仪器制造有限公司），HH-S数显恒温水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂），RE-85Z旋转蒸发仪（巩义市英峪予华仪器厂），KQ-3200 DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），DZF-6020真空干燥箱（巩义市英峪予华仪器厂），SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），101A-S1型数显电热鼓风干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司），DF-10A摇摆式中药粉碎机（温岭市奥力中药机械有限公司）。
黄芪，合肥天星乐家老铺中药饮片有限公司，批号12072102；雷公藤，合肥天星乐家老铺中药饮片有限公司，批号12072102。所用药材均经安徽中医药大学第一附属医院李立华教授鉴定符合现行药典规定。雷公藤内酯酮对照品，北京盛世康普化工技术研究院，纯度≥98%，批号20130826；甲醇为色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，批号20130918；水为屈臣氏蒸馏水，其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：welch material Inc C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相：甲醇-水溶液（55∶45）；流速：1.0 mL/min；检测波长：218 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 ?L。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取雷公藤内酯酮对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.021 5 mg/mL的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 雷公藤药材干燥后打成细粉，过40目筛，取药材粉末10 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加75%乙醇回流提取2次，第1次加10倍量乙醇、回流2.0 h，第2次加8倍量乙醇、回流1.5 h，合并醇提液，过滤，回收乙醇。药渣加8倍量水煎煮提取1.5 h，过滤，吸取上清液，同醇提液合并减压浓缩收膏，真空干燥，得干浸膏。将所得的干浸膏置索氏提取器中，加150 mL乙酸乙酯-甲醇（15∶1）于提取器中，于约97 ℃水浴中回流4 h，将回流液挥干部分溶剂，浓缩至约20 mL左右时转移至已用30 mL乙酸乙酯预洗的中性氧化铝（100～200目）的层析柱中，再以80 mL乙酸乙酯洗脱，收集流出液和洗脱液，于水浴锅中蒸除乙酸乙酯，残渣用甲醇超声5 min以上使充分溶解，定容于5 mL容量瓶中，过0.45 ?m微孔滤膜，作为雷公藤供试品溶液。取雷公藤药材10 g、黄芪20 g（均过40目筛），其余供试品溶液提取步骤同上，定容于5 mL容量瓶中，过0.45 ?m微孔滤膜，作为雷黄组供试品溶液。
2.3 专属性试验
按“2.1”项下色谱条件，吸取对照品溶液、雷公藤供试品溶液、雷黄组供试品溶液各10 ?L，分别注入色谱仪，进行测定。对照品及样品色谱图见图1。从色谱图中可以看出，两供试品色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，在相同保留时间有对应的色谱峰。在此色谱条件下，雷公藤内酯酮达到基线分离，样品中其他成分对雷公藤内酯酮的测试无干扰。
2.4 线性关系考察
精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 ?L、按“2.1”项下色谱条件进样测定，以进样量（?g）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=1958.5X-2.446 7（r=0.999 9），结果表明雷公藤内酯酮进样量在0.043～0.258 ?g范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。 2.5 精密度试验
精密吸取上述对照品溶液各10.0 ?L，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD，结果峰面积RSD=1.00%，表明仪器精密度较好，符合要求。
2.6 稳定性试验
精密吸取按“2.2.2”项下方法制备的雷公藤供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定并记录峰面积，计算RSD。结果峰面积RSD=1.38%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好，符合要求。
2.7 重复性试验
取同一批号的雷公藤药材6份，约10 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法分别制成雷公藤供试品溶液，精密吸取10 ?L，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积。结果雷公藤中雷公藤内酯酮含量RSD=1.58%，表明本试验重复性较好，符合要求。
2.8 加样回收率试验
取已知含量同一产地、同一批号的雷公藤药材，共6份，约10 g，精密称定，按照试验要求，分别加入一定体积的配制好浓度的雷公藤内酯酮对照品溶液（0.20 mg/mL），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，过0.22 ?m微孔滤膜，按上述色谱条件进行测定，结果见表1。
2.9 供试品含量测定
取3份10 g雷公藤、3份10 g雷公藤和20 g黄芪，分别按供试品溶液制备方法制备3份雷公藤供试品溶液和3份雷黄组供试品溶液，按照上述色谱条件进样，计算雷公藤内酯酮含量，结果见表2。可知，雷黄组中的雷公藤内酯酮含量低于雷公藤中的雷公藤内酯酮含量，说明黄芪配伍雷公藤后降低了雷公藤内酯酮的含量。
3 讨论
配伍是中医方剂学的核心内容，药物七情理论是中药配伍理论的核心部分。《神农本草经·序录》云：“若有毒宜制，可用相畏相杀者。”“相畏相杀”通过抑制或消除毒副作用达到全面兼顾、拮抗或消除毒性。临床以黄芪配伍雷公藤，使其共同形成一种相互对立、相互依存、缺一不可的相畏相杀关系，达到相制相成、存利除弊、调偏、制毒的目的。辛苦之药雷公藤，引燥为胜；黄芪性甘、微温，补气升阳、益卫固表。刚燥大毒雷公藤配伍甘温柔润黄芪，以甘温柔润制其刚燥大毒，温煦与司腠理开阖[13-14]。
雷公藤内酯酮是雷公藤中的环氧二萜内酯类化合物，此类结构对高温、酸碱较敏感，故在热水碱中内酯结构容易开环。黄芪的主要有效成分是黄芪苷，实验测得其提取液呈弱碱性，以黄芪配伍雷公藤后，黄芪苷的弱碱性使雷公藤内酯酮开环，从而降低了指标成分的含量。故笔者推断以上就是黄芪配伍雷公藤降低雷公藤毒性的可能作用机制。本课题组后期将进行毒理实验研究，进一步验证雷公藤内酯酮含量的变化与配伍减毒的相关性，揭示中药配伍的可能作用机制。
参考文献：
[1] 郑家润，顾克显，徐兰芳，等.雷公藤抗炎免疫及抗生育活性成份的筛选——Ⅲ.7个环氧二萜内酯化合物体内抗炎免疫活性的比较[J].中国医学科学院学报，1991，13（6）：391-397.
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[6] 徐晖，黄颖.中药治疗类风湿关节炎的研究进展[J].云南中医中药杂志，2015，36（1）：88-90.
[7] 石卫东.论扶正祛邪法则的临床意义[J].光明中医，2011，26（3）：421- 423